microRNA在耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)及microRNa-30a-5p在卵巢癌耐藥中的作用.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分：耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系中microRNA的差異表達(dá)
　　目的:
　　利用基因芯片研究兩組卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP和SKOV3，COC1/DDP和COC1中microRNA的表達(dá)譜，通過檢測耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)microRNA的差異性，為未來相關(guān)領(lǐng)域?qū)ふ也⒎治雎殉舶┑你K類耐藥的治療靶點(diǎn)給予新的研究方向。
　　方法:
　　常規(guī)培養(yǎng)SKOV3/DDP和

2、SKOV3，COC1/DDP和COC1細(xì)胞株，Trizol法分別抽提總RNA，對microRNA分別進(jìn)行Cy3和Cy5熒光標(biāo)記，將所選細(xì)胞系與包含人類和小鼠的共924條microRNA成熟的序列進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行microRNA微陣列芯片雜交檢測分析，獲得microRNA表達(dá)譜，利用RT-PCR方法對篩選出的microRNA進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，鑒定出與卵巢癌耐藥相關(guān)的microRNA。
　　結(jié)果:
　　1.RNA的質(zhì)量檢測:從S

3、KOV3/DDP和SKOV3，COC1/DDP和COC1細(xì)胞株提取出的總RNA濃度值依次為:0.61、0.78、1.38及1.53（單位為μg/μl），A260/A280比值均處于1.9～2.0范圍內(nèi)，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，清晰的條帶包括18S及28S，其亮度比大概等于1∶2，提取的總RNA純度符合研究要求，未發(fā)生顯著的降解。
　　2.microRNA芯片測定結(jié)果:本研究經(jīng)過Cy3及Cy5熒光顏色標(biāo)記、純化、基因芯片雜交、

4、圖像采集、數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，分別以兩種細(xì)胞Cy3、Cy5熒光標(biāo)記信號強(qiáng)度的比值為標(biāo)準(zhǔn)來判定差異表達(dá)的microRNA。結(jié)果顯示:其中SKOV3/DPP vs SKOV3細(xì)胞系中hsa-miR-99a-5p，hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-34c-5p,hsa-miR-31-3p,hsa-miR-181d等19個(gè)microRNAs高表達(dá)，hsa-miR-96-5p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-193b

5、-3p等20個(gè)microRNAs低表達(dá)。COC1/DPP vs COC1細(xì)胞系中hsa-miR-34a-5p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-181 c-3p等22個(gè)microRNAs高表達(dá)，hsa-miR-892b，hsa-miR-505-5p等24個(gè)microRNAs低表達(dá)。其中hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-181在兩種耐藥卵巢癌細(xì)胞系中均表達(dá)升高。
　　結(jié)論:
　　在耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系

6、SKOV3/DDP和SKOV3，COC1/DDP和COC1中microRNA的表達(dá)譜存在明顯差異。在所有差異表達(dá)的microRNAs中，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-181在兩種化療耐藥卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)水平均高于敏感細(xì)胞系，推測二者可能是在microRNA水平與卵巢癌化療耐藥相關(guān)的指標(biāo)，而且利用RT-PCR方法對miR-30a-5p，hsa-miR-181在兩種化療耐藥卵巢癌細(xì)胞系中進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，與基因芯片的結(jié)果一致

7、，且以miR-30a-5p升高最為顯著。
　　第二部分：microRNA-30a-5p對卵巢癌耐藥細(xì)胞的影響
　　目的:
　　選擇敏感及耐藥卵巢癌細(xì)胞系中差異表達(dá)最顯著的microRNA-30a-5p作為研究因子，探討microRNA-30a-5p對卵巢癌細(xì)胞耐藥的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA芯片篩選的結(jié)果。
　　方法:
　　常規(guī)培養(yǎng)SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞系，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測定

8、細(xì)胞系中microRNA-30a-5p的表達(dá)情況，同時(shí)檢測卵巢癌敏感及耐藥組織標(biāo)本中microRNA-30a-5p的表達(dá)情況。lipofectamin2000轉(zhuǎn)染microRNA-30a-5p pre-mir、inhibitors至敏感及耐藥細(xì)胞中，通過熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測定細(xì)胞系和卵巢癌組織標(biāo)本中micr

9、oRNA-30a-5p的表達(dá)情況:microRNA-30a-5p在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)升高;在卵巢癌耐藥的組織標(biāo)本中表達(dá)也升高，結(jié)果與細(xì)胞株microRNA芯片結(jié)果一致。
　　2.SKOV3/DDP和SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后microRNA-30a-5p的表達(dá)改變:實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-miR30a-5p24h后microRNA-30a-5p的△Ct為2.3，陰性對照組△Ct為7.7。轉(zhuǎn)染pre

10、-miR30a-5p24h后，和陰性對照組相比，測定microRNA-30a-5p的表達(dá)量高出42.2倍。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor24h后microRNA-30a-5p的△Ct為8.9，陰性對照組△Ct為5.6。轉(zhuǎn)染inhibitor24h后，和陰性對照組相比，測定microRNA-30a-5p的表達(dá)量高出9.8倍（負(fù)相關(guān)），表明轉(zhuǎn)染成功。
　　3.microRNA-30a-5p

11、對SKOV3/DDP和SKOV3細(xì)胞耐藥性的影響:轉(zhuǎn)染pre-miR30a-5p后的SKOV3細(xì)胞增加了對順鉑的耐藥性。IC50為:3.5±0.26ug/ml;陰性對照組為:1.8±0.12ug/ml。兩者差異顯著（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染inhibitor后的SKOV3/DDP細(xì)胞降低了對順鉑的耐藥性。IC50為:7.6±0.38 ug/ml;陰性對照組為:13±0.47ug/ml。兩者差異顯著(P＜0.05)。
　　4.micro

12、RNA-30a-5p對SKOV3/DDP和SKOV3水平產(chǎn)生的影響:轉(zhuǎn)染pre-miR30a-5p24h后，和陰性對照組相比，細(xì)胞接種的第2天起細(xì)胞水平明顯升高(P＜0.05），細(xì)胞的活性顯著上升。轉(zhuǎn)染inhibitor24h后，和陰性對照組相比，細(xì)胞接種的第2天起細(xì)胞水平明顯下降(P＜0.05），細(xì)胞的活性顯著降低。
　　結(jié)論:
　　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的結(jié)果與細(xì)胞株基因芯片表達(dá)譜分析一致，microRNA-30a-5

13、p在卵巢癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，在化療耐藥型組織標(biāo)本中也有較高的表達(dá)，提高microRNA-30a-5p的表達(dá)可以增加敏感細(xì)胞的耐藥性、提高細(xì)胞活性。故推測卵巢癌耐藥可能與microRNA-30a-5p的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。設(shè)想是否將來臨床可以通過下調(diào)microRNA-30a-5p的表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的耐藥，增加其對順鉑的敏感性。
　　第三部分：microRNA-30a-5p在卵巢癌耐藥細(xì)胞中的作用
　　目的:
　　通過上調(diào)

14、或下調(diào)microRNA-30a-5p在卵巢癌敏感及耐藥細(xì)胞中的表達(dá)，檢測對卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力及裸鼠呈瘤能力的影響，探討microRNA-30a-5p在卵巢癌細(xì)胞耐藥中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　通過轉(zhuǎn)染pre-miR30a-5p或者inhibitor，上調(diào)或下調(diào)敏感及耐藥細(xì)胞中microRNA-30a-5p的表達(dá)，通過測定細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)來檢測其對細(xì)胞增殖能力的影響;通過transwe

15、ll遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測其對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　轉(zhuǎn)染microRNA-30a-5p inhibitor進(jìn)入卵巢癌耐藥細(xì)胞中，可以抑制細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞克隆形成和裸鼠成瘤能力并在體外減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。而轉(zhuǎn)染pre-miR30a-5p進(jìn)入卵巢癌親本株中，能促進(jìn)細(xì)胞生長，促進(jìn)形成細(xì)胞集落和裸鼠成瘤，提升體外細(xì)胞的侵襲及遷移作用。
　　結(jié)論:
　　microRNA-30a-5p能促進(jìn)細(xì)胞生長、