P-gp在卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇耐藥中的作用及耐藥逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性健康?；熓锹殉舶┬g(shù)后的重要輔助治療手段, 紫杉醇在卵巢癌化療中占有重要地位。但卵巢癌在經(jīng)過數(shù)個療程化療后,腫瘤細(xì)胞往往會出現(xiàn)獲得性耐藥,致使后續(xù)化療失敗。因此,如何克服卵巢癌化療的多藥耐藥(multidrug resistance ,MDR)成為近年來腫瘤臨床研究的熱點(diǎn)。 紫杉醇耐藥的機(jī)制很多，涉及P-糖蛋白(P-glyco-protein, P-gp)表達(dá)的升高，微管β亞基的

2、改變，微管α亞基的改變，凋亡途徑改變等。P-gp 是多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)編碼的一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有ATP 酶活性，能將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，降低細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度而致多藥耐藥。而P-gp 又由蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)磷酸化而具有活性。因此，我們培養(yǎng)了對紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780/Taxol，研究其P-gp 及PKC 的表達(dá)，觀察使用PK

3、C 抑制劑和激動劑后P-gp 表達(dá)量及功能的變化，同時應(yīng)用RNAi 技術(shù)沉默P-gp 的表達(dá)并觀察沉默后的耐藥細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積的濃度，為逆轉(zhuǎn)耐藥提供依據(jù)。 目的： 1.培養(yǎng)對紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780/Taxol，研究其表面P-gp 及PKC-α的表達(dá)； 2.觀察使用PCK 抑制劑SP 和激動劑PMA 后A2780/Taxol 細(xì)胞表面P-gp表達(dá)量及功能的變化； 3.應(yīng)用RNAi 沉默A2780/T

4、axol 細(xì)胞MDR1基因，下調(diào)其表面P-gp 的表達(dá)并觀察沉默后的耐藥細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積的濃度，明確沉默MDR1 基因后表達(dá)后能否逆轉(zhuǎn)耐藥。 方法： 1.免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光雙標(biāo)檢測PKC-α與P-gp 在耐藥細(xì)胞A2780/Taxol 及其親本細(xì)胞中的表達(dá)； 2.Westernblot 檢測并半定量分析PKC 激動劑PMA 和抑制劑SP 作用后P-gp 在兩種細(xì)胞上的表達(dá)水平； 3.以R123 作為熒光

5、探針,采用流式細(xì)胞儀檢測PMA 及SP 對細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的影響； 4.構(gòu)建RNAi MDR1真核表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至A2780/Taxol 細(xì)胞，Westernblot 檢測P-gp 沉默效果，MTT 法繪制生長曲線，并按方法3 檢測細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積濃度。 結(jié)果： 1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明在A2780/Taxol 中，P-gp 與PKC 表達(dá)均呈陽性，而在親本細(xì)胞中，P-gp 不表達(dá)，PKC 呈陽性表達(dá)。免疫熒

6、光雙標(biāo)結(jié)果顯示在A2780/Taxol 中PKC-α與P-gp 有共表達(dá)。 2.SP 及PMA 作用后，A2780/Taxol 細(xì)胞中P-gp 的表達(dá)量無明顯差別。 3.PMA 作用后A2780/Taxol 細(xì)胞內(nèi)R123 的平均熒光強(qiáng)度減低,SP 作用后,A2780/Taxol 細(xì)胞內(nèi)R123 的平均熒光強(qiáng)度明顯增加。敏感細(xì)胞A2780 則無此現(xiàn)象。 4.成功構(gòu)建RNAi MDR1 真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至A278

7、0/Taxol 細(xì)胞，G418篩選，成功獲得陽性克隆株。5.MTT 結(jié)果提示轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞生長曲線無明顯差別。Westerblot 結(jié)果顯示A2780/Taxol 細(xì)胞MDR1 基因被特異沉默了，但是針對不同部位序列的shRNA 真核表達(dá)載體抑制效率不同，R123 外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的A2780/Taxol/ pWH1- MDR12 細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積濃度明顯大于A2780/Taxol細(xì)胞。 結(jié)論： 1.卵巢癌細(xì)胞A2

8、780 對紫杉醇耐藥性產(chǎn)生與P-gp 過表達(dá)有關(guān)； 2.PKC 活性的改變并不能改變A2780/Taxol 細(xì)胞P-gp 的表達(dá)量，但是可以通過使P-gp 磷酸化增強(qiáng)或減弱來增高或降低其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能； 3.RNAi 技術(shù)特異性沉默A2780/Taxol 細(xì)胞MDR1 的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積濃度明顯增高。 4.采用PKC 抑制劑抑制A2780/Taxol 細(xì)胞P-gp 的功能或利用RNAi 技術(shù)降低其表面P-gp