納秒電脈沖誘導(dǎo)人卵巢癌順鉑敏感及耐藥細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌為死亡率居首位的女性生殖器惡性腫瘤，耐藥性的產(chǎn)生直接影響卵巢癌化療效果及患者生存率，因此克服卵巢癌細(xì)胞耐藥是卵巢癌治療亟需解決的問題。納秒脈沖電場(chǎng)(nanosecond pulsed electric fields, nsPEFs)因其特有的細(xì)胞內(nèi)處理效應(yīng)及非熱損傷特點(diǎn)，受到國內(nèi)外生物工程領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者們極大關(guān)注，研究表明利用納秒脈沖電場(chǎng)治療腫瘤具有潛在優(yōu)勢(shì)。
　　研究表明在特定脈沖參數(shù)納秒脈沖電場(chǎng)作用后，線粒體介導(dǎo)了

2、某些腫瘤細(xì)胞凋亡。本課題組前期實(shí)驗(yàn)提示，納秒脈沖電場(chǎng)有可能誘導(dǎo)COC1和COC1/DDP細(xì)胞線粒體途徑凋亡。本實(shí)驗(yàn)選擇體外培養(yǎng)的人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株COC1及耐藥細(xì)胞株COC1/DDP為研究對(duì)象，試圖利用納秒脈沖電場(chǎng)跨細(xì)胞膜傳遞而直接作用于細(xì)胞核、線粒體等亞細(xì)胞單位的特性，以期為納秒級(jí)脈沖電場(chǎng)對(duì)耐藥腫瘤的治療提供初步依據(jù)。
　　目的：
　　探討納秒脈沖電場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)的人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞COC1及順鉑耐藥細(xì)胞COC1/DD

3、P的生長抑制、凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)及可能機(jī)制。
　　方法：
　　COC1和COC1/DDP細(xì)胞處理組以脈寬32 ns、場(chǎng)強(qiáng)10 kV/cm的納秒脈沖電場(chǎng)處理10 min，對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)nsPEF處理。WST-8法分析nsPEF處理后0.5 h、6 h、12 h和24 h，COC1及COC1/DDP實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞存活率；為研究nsPEFs處理后12 h凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)及可能機(jī)制，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀

4、檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,同時(shí)用Hochest33342熒光染色觀察細(xì)胞核變化；JC-1熒光染色定量及定性分析線粒體膜電位變化；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)caspase-3蛋白酶活性；PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：
　　1.納秒脈沖電場(chǎng)處理后0.5 h、6 h、12 h和24 h，與對(duì)照組相比，COC1處理組細(xì)胞存活率降低(P=0.001；P=0.001；P=0.001；P=0.013)，COC1/DDP處理組細(xì)胞存活率也降低(

5、P<0.001；P=0.001；P<0.001；P<0.001)，兩種細(xì)胞在納秒脈沖作用后12 h細(xì)胞存活率最低。納秒脈沖作用后各時(shí)間點(diǎn)，與COC1細(xì)胞相比，COC1/DDP細(xì)胞存活率較高(P=0.001；P<0.001；P<0.001；P=0.026)。
　　2.納秒脈沖電場(chǎng)處理后12 h，與對(duì)照組相比，COC1處理組細(xì)胞早期及晚期凋亡率均高(P=0.001；P=0.001)，COC1/DDP處理組細(xì)胞早期及晚期凋亡率也增加(P

6、=0.005；P=0.016)，與 COC1處理組相比，COC1/DDP處理組早期及晚期凋亡率均較低(P=0.002；P=0.001)；Hochest33342染色兩種細(xì)胞處理組均可以明顯地看到凋亡小體和呈亮藍(lán)色致密濃染的顆粒塊狀熒光。
　　3.納秒脈沖電場(chǎng)處理后12 h，J C-1熒光染色COC1/DDP處理組細(xì)胞出現(xiàn)較多橘黃色或彌散分布的綠色熒光，COC1處理組細(xì)胞則大多呈彌散分布的綠色熒光；與對(duì)照組相比， COC1處理組及C

7、OC1/DDP處理組JC-1紅/綠熒光比值均降低(P=0.001；P=0.002)。
　　4.納秒脈沖電場(chǎng)處理后12 h，COC1細(xì)胞處理組caspase-3活性為對(duì)照組1.26±0.04倍，COC1/DDP細(xì)胞處理組 caspase-3活性為對(duì)照組1.16±0.02倍，兩者處理組caspase-3活性均比對(duì)照組增高(P=0.000；P=0.000)。
　　5.納秒脈沖電場(chǎng)處理后12 h，與對(duì)照組相比，COC1處理組處于G0

8、/G1期細(xì)胞百分率減少(P=0.002)，處于S期細(xì)胞百分率升高(P=0.007)。COC1/DDP細(xì)胞處于G0/G1期、S期及G2/M期細(xì)胞百分率對(duì)照組與處理組間均無明顯差別(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　納秒脈沖電場(chǎng)抑制COC1及COC1/DDP細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯COC1細(xì)胞周期于S期。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，線粒體的膜電位( mitochondrial transmembranepotential,ΔΨm)