納秒脈沖電場誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、惡性腫瘤已成為目前危害人類身體健康最嚴(yán)重的疾病之一。外科手術(shù),化療,放療等傳統(tǒng)的各種治療手段都存在不同程度的缺陷,電化學(xué)療法在通過電場作用增加細(xì)胞或腫瘤組織的透化作用的情況下,降低用藥量的同時(shí)提高了治療效果,但仍不能完全避免藥物對機(jī)體的毒副作用。納秒級脈沖電場刺激(nsPEFs)是一種殺傷腫瘤細(xì)胞的新方法。已有的研究表明,nsPEFs可以在多種類型的細(xì)胞中作用于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并對凋亡信號產(chǎn)生誘導(dǎo)作用從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但具體的作用機(jī)制,作用部

2、位以及凋亡通路還不明確。在本文的研究中,我們用場強(qiáng)為10kV/cm,脈寬為500ns,頻率1Hz的脈沖電場對人肝癌細(xì)胞HepG2施加不同時(shí)間的刺激,通過細(xì)胞凋亡效率檢測,形態(tài)學(xué)觀察,細(xì)胞膜的通透性、線粒體跨膜電位的變化,及細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)因子和鈣離子的研究來探索電場的生物學(xué)效應(yīng)及可能的凋亡機(jī)理。以期為癌癥特別是肝癌的脈沖電場治療或其他的相關(guān)研究提供理論依據(jù)和參考。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　?、俜謩e對細(xì)胞施加0、10、20、30

3、及60個脈沖電場刺激后,用AnnexinV-FITC和PI雙染的方法結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行凋亡率檢測。結(jié)果表明,隨著刺激時(shí)間的增加,細(xì)胞凋亡比例也隨之增加,nsPEFs在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2早期凋亡方面具有明顯效果。
　?、谕ㄟ^透射電鏡對經(jīng)過脈沖電場刺激后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和未經(jīng)電場刺激的對照組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過電場刺激后的細(xì)胞,出現(xiàn)了如核仁消失,核染色質(zhì)固縮、核膜皺褶甚至消失的現(xiàn)象,出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。結(jié)

4、果表明電場刺激能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且隨著電場刺激時(shí)間的增加,凋亡效果呈增長趨勢,但120s的電場刺激會導(dǎo)致細(xì)胞大量溶解性壞死。
　　③通過碘化丙啶(PI)探針對細(xì)胞進(jìn)行染色,結(jié)合熒光倒置相差顯微鏡對電場刺激后的細(xì)胞膜通透性(電穿孔)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):施加電場能量越高,細(xì)胞“穿孔”越快,比例越大。同時(shí),本文通過對這種nsPEFs引起的“穿孔”是否恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)檢測,結(jié)果顯示,到電場刺激后4h,PI紅色熒光還非常強(qiáng),細(xì)胞穿孔未見明顯恢復(fù),因此,

5、本文所用的脈沖電場刺激誘導(dǎo)HepG2產(chǎn)生的“穿孔”是不可逆的。
　?、芡ㄟ^羅丹明123對細(xì)胞進(jìn)行染色,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對電場刺激后的細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測,結(jié)果顯示:細(xì)胞受到脈沖電場刺激后的幾秒鐘內(nèi)即出現(xiàn)線粒體膜電位下降的現(xiàn)象,但兩個實(shí)驗(yàn)組(20s,60s)之間沒有明顯差別。接下來通過JC-1熒光探針結(jié)合熒光光譜儀對電場刺激后的細(xì)胞膜電位進(jìn)行檢測,分別在電場刺激后1h,2h和4h檢測結(jié)果,各時(shí)間點(diǎn)檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞受到電

6、場刺激后,隨著刺激時(shí)間的增加,線粒體膜電位呈下降趨勢,且20s組和60s組相對于對照組均有顯著性差異。但隨著時(shí)間的推移,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體膜電位呈向正常水平恢復(fù)的趨勢,到4h的時(shí)候,20s實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的線粒體膜電位已臨近正常水平。
　?、萃ㄟ^Fluo-3AM探針對細(xì)胞染色,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對不同時(shí)間(20s、60s)脈沖電場刺激后的細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測結(jié)果顯示:nsPEF刺激能誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子,胞內(nèi)鈣離子濃度迅速

7、增加,峰值分別達(dá)到刺激前的3.192倍(20s)和1.746倍(60s)。通過熒光光譜儀對電場刺激后的細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子檢測發(fā)現(xiàn),1h后胞內(nèi)鈣離子水平已基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),20s組細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度恢復(fù)至正常水平,而60s電場刺激后的細(xì)胞樣品,胞內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對照組和20s刺激組。表明不同參數(shù)的電場刺激可影響胞內(nèi)鈣離子的響應(yīng)。
　?、尥ㄟ^實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot的方法對電場刺激后的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的變化進(jìn)行了檢測,