納秒級(jí)陡脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤凋亡作用及機(jī)制的研究.pdf

1、已有研究表明不同參數(shù)的脈沖電場(chǎng)對(duì)惡性腫瘤產(chǎn)生的影響分別為以細(xì)胞電穿孔為基礎(chǔ)的電穿孔療法（EPT）[1-2]、以不可逆性電穿孔效應(yīng)為基礎(chǔ)的能量可控性陡脈沖療法[3-4]、以能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為特點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)處理效應(yīng)[5-11]。內(nèi)處理效應(yīng)是指細(xì)胞在場(chǎng)強(qiáng)≥10 kV/cm的ns（納秒）級(jí)陡脈沖作用下出現(xiàn)的一系列與μs（微秒）級(jí)陡脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞膜電穿孔現(xiàn)象和能量可控陡脈沖引起細(xì)胞不可逆性電擊穿截然不同的細(xì)胞反應(yīng)，表現(xiàn)為核膜穿孔、微核產(chǎn)生、基因表達(dá)增強(qiáng)

2、；線粒體穿孔并導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子釋放；誘導(dǎo)細(xì)胞周期改變等。ns級(jí)陡脈沖因其等值頻率很高能穿透細(xì)胞膜（外膜），使得內(nèi)膜（包括細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等出現(xiàn)一系列的功能性改變即為內(nèi)處理效應(yīng)，為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡提供了可能。本實(shí)驗(yàn)小組對(duì)納秒級(jí)脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的研究已經(jīng)全面展開(kāi)，在前期的離體實(shí)驗(yàn)中，納秒級(jí)陡脈沖對(duì)離體人卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用[12]的研究已經(jīng)初具成效。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）對(duì)納秒級(jí)陡脈沖（

3、陡脈沖與納秒級(jí)脈沖相結(jié)合的電場(chǎng)）誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤凋亡的形態(tài)及功能學(xué)觀察及凋亡機(jī)制探討，進(jìn)一步為納秒級(jí)陡脈沖應(yīng)用于婦科腫瘤治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：觀察納秒級(jí)陡脈沖對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制和凋亡電鏡觀察。 方法：采用人黑色素瘤細(xì)胞A375種植于裸鼠背部皮下，成瘤后采用參數(shù)為300ns、20KV/cm、f=1hz的脈沖電場(chǎng)作用于移植瘤5分鐘，每?jī)商焯幚硪淮危蔡幚砣?。分別觀察處理組和對(duì)照組

4、各時(shí)相瘤體體積大小變化，計(jì)算抑瘤率；電鏡觀察腫瘤超微結(jié)構(gòu)改變，即形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：陡脈沖治療組裸鼠腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（P<0.01），呈明顯抑制作用；電鏡下出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡改變。 結(jié)論：納秒級(jí)陡脈沖能明顯抑制人黑色素瘤細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)，亦誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡，電鏡下獲得典型凋亡形態(tài)學(xué)改變。 目的：觀察納秒級(jí)陡脈沖對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用、Caspase-3表達(dá)的影響及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度即[C

5、a2+]i的影響。 方法：采用參數(shù)為300ns、20KV/cm、f=1hz的脈沖電場(chǎng)作用于移植瘤5分鐘，每?jī)商焯幚硪淮?，共處理三次。免疫熒光檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)A375細(xì)胞的凋亡率；RT-PCR方法檢測(cè)caspase-3 mRNA表達(dá)；以Fluo-3/AM為細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光指示劑，熒光分光光度計(jì)測(cè)定Ca2+濃度，檢測(cè)納秒級(jí)陡脈沖對(duì)A375細(xì)胞[Ca2+]i的影響。 結(jié)果：免疫熒光結(jié)果為cas

6、pase-3蛋白表達(dá)處理組比對(duì)照組明顯增多；TUNEL法測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果為處理組與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率顯著增加；RT-PCR結(jié)果為caspase-3mRNA表達(dá)處理組比對(duì)照組明顯增多；熒光分光光度計(jì)測(cè)量處理組Ca2+濃度顯著增加。 結(jié)論：納秒級(jí)陡脈沖能夠誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡，且與對(duì)照組相比凋亡率顯著增加，導(dǎo)致Caspase-3mRNA和蛋白的表達(dá)大幅增多。細(xì)胞內(nèi)鈣釋放引起的鈣離子升高，可能是納秒級(jí)陡脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一