UVA輻射聯(lián)合鴉膽子苦醇誘導(dǎo)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、背景：
　　黑色素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤。盡管已有長期且廣泛的研究，但由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)、過表達(dá)多種耐藥性蛋白及有效的DNA修復(fù)機(jī)制等多種復(fù)雜表型，且轉(zhuǎn)移速度快，惡性程度高，對化療放療均不敏感等特性使其難以治愈。65％的黑色素瘤患者存在BRAF基因突變，所以目前治療黑色素瘤的研究熱點(diǎn)是研發(fā)針對BRAF突變的靶向藥物（如vemurafenib和dabrafenib）。這些藥物在短期內(nèi)具有較好的藥效，但不到一年患者體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生耐藥

2、性。基于惡性黑色素瘤的耐藥性現(xiàn)狀，我們嘗試選擇癌細(xì)胞中另一種重要的超表達(dá)耐藥性基因—轉(zhuǎn)錄因子Nrf2（NF-E2relatedfactor2）作為切入點(diǎn)，Nrf2在細(xì)胞防御保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。鴉膽子苦醇(brusatol)作為一種獨(dú)特的Nrf2抑制劑可協(xié)助化療藥物治療肺癌，但其在惡性黑色素瘤細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)及聯(lián)合光療如UVA治療惡性黑色素瘤等方面尚未有報(bào)道。
　　目的：
　　采用梯度強(qiáng)度（25,50,75,100kJ/m

3、2）UVA輻射，檢測其對人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞活性的影響；檢測75kJ/m2UVA輻射對A375細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO-1、NQO1、GSTP1表達(dá)的影響；檢測75kJ/m2UVA輻射對A375細(xì)胞NF-κB信號通路相關(guān)IκBα和COX2蛋白水平的影響。
　　檢測不同濃度（10,20,30,40,50,100nM）brusatol對A375細(xì)胞活性的影響；檢測50nMbrusatol處理對A375細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO

4、-1、NQO1、GSTP1表達(dá)的影響；檢測50nMbrusatol處理對A375細(xì)胞NF-κB信號通路IκBα和COX2蛋白表達(dá)的影響。
　　75kJ/m2UVA輻射后2h再用50nMbrusatol處理A375細(xì)胞，檢測Bcl-2家族Bcl-2、Bcl-xl、Bax蛋白水平變化；75kJ/m2UVA輻射后2h再用50nMbrusatol處理A375細(xì)胞，檢測24h后細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax、caspase3、casp

5、ase7、caspase8、caspase9、cleaved-PARP蛋白水平變化；分別檢測75kJ/m2UVA輻射組、50nMbrusatol處理組及75kJ/m2UVA+50nMbrusatol處理組，人正常角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的凋亡狀況。
　　研究方法：
　　MTS法檢測A375細(xì)胞的增殖活性；Westernblotting電泳檢測GRP78、ATF4、CHOP、Nrf2等蛋白水平；流式細(xì)胞

6、技術(shù)檢測HaCaT和A375細(xì)胞的凋亡狀況。
　　結(jié)果：
　　①75kJ/m2UVA輻射后A375細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其靶基因蛋白水平上調(diào)，IκBα和COX2蛋白水平有降低趨勢。
　　75kJ/m2UVA輻射對A375細(xì)胞活性損傷小于10%，不會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞的增殖活性；Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白水平顯著上升，Nrf2總蛋白水平在4-6h左右達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2下游抗氧化應(yīng)激蛋白HO-1、NQO1

7、、GSTP1在24h內(nèi)總體水平逐漸升高；NF-κB的抑制子IκBα蛋白水平有降低趨勢。COX2蛋白水平也呈降低趨勢，8h左右蛋白水平最低，而后逐漸升高并顯著高于對照組。
　?、?0nMbrusatol處理誘導(dǎo)A375細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)升高，抑制Nrf2和GSTP1蛋白水平，IκBα水平?jīng)]有顯著性變化。
　　MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50nM鴉膽子苦醇不會(huì)明顯影響A375細(xì)胞活性。50nMbrusatol處理后A375細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

8、激蛋白GRP78、ATF4、CHOP水平呈時(shí)間依賴性高表達(dá)；Nrf2總蛋白水平逐漸降低，4h左右降到最低值，8h恢復(fù)后再次降低。Nrf2靶基因GSTP1蛋白水平逐步降低；IκBα蛋白水平?jīng)]有顯著性差異，炎癥因子COX2蛋白水平明顯升高。
　　③75kJ/m2UVA輻射聯(lián)合50nMbrusatol處理后A375細(xì)胞凋亡率顯著上升至30%，而單獨(dú)75kJ/m2UVA輻射細(xì)胞凋亡率約10%，50nMbrusatol處理則不會(huì)顯著誘導(dǎo)A3

9、75細(xì)胞凋亡。
　　聯(lián)合處理后Bcl-2家族中抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xl的蛋白水平呈時(shí)間依賴性降低趨勢，促凋亡的Bax蛋白水平呈遞增趨勢。聯(lián)合處理24h后A375細(xì)胞內(nèi)Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase3與對照組相比明顯升高，Bcl-2、Bcl-xl、caspase7等蛋白水平與對照組相比明顯降低。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示聯(lián)合處理組的凋亡率明顯高于對照組和兩個(gè)單獨(dú)處理組。
　　結(jié)論：