β-catenin對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　惡性黑色素瘤是一種較常見的惡性腫瘤,好發(fā)于皮膚部,惡性程度高,平均生存期約30.3個(gè)月,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前,治療惡性黑色素瘤主要的手段有手術(shù)及抗腫瘤治療(化療、放療、生物治療),但其療效均較差。于是尋求一種新的有效治療措施有著重要意義。近年來,發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展均有密切聯(lián)系,但其作用機(jī)制沒有被完全認(rèn)知?，F(xiàn)已認(rèn)為,Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心蛋白β-ca

2、tenin在細(xì)胞漿內(nèi)異常聚積是Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)利用含有β-catenin特異序列RNA干擾慢病毒沉默β-catenin蛋白的表達(dá),以此阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,觀察β-catenin沉默對(duì)惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響。
　　目的:
　　探討通過沉默Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin,觀察β-catenin對(duì)人惡性黑

3、色素瘤A375細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的影響,從而為惡性黑色素瘤的治療提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.制作干擾慢病毒液:β-catenin-RNAi-LV(β-catenin干擾慢病毒液)和β-catenin-negative-LV(空載體慢病毒液)。分別感染人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞,得到的穩(wěn)定感染細(xì)胞株分別標(biāo)記為A375-RNAi、A375-negative。采用Western Blot法檢測(cè)感染后的A375-RNA

4、i、A375-negative細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平,并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。
　　2. MTT法分別檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞增殖能力,并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。
　　3.采用細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞平板克隆形成能力,并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。
　　4.采用Transwell法檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞

5、體外趨化侵襲、遷移能力,并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)亞G1峰法檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞的凋亡率,并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。
　　結(jié)果:
　　1. Western Blot結(jié)果顯示:β-catenin在人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中高表達(dá),β-catenin在A375-RNAi細(xì)胞中的表達(dá)量下降,A375-RNAi細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)量較未感染的 A375細(xì)胞下降約5

6、5.1％( P<0.05),證實(shí)β-catenin被β-catenin-RNAi-LV有效沉默;A375-negative細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)量與A375細(xì)胞無明顯差異(P>0.05)。
　　2. MTT結(jié)果顯示:A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞相比增殖活性均降低(P<0.05);A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞增殖活性無明顯差異(P>0.05)。
　　3.細(xì)胞平板

7、克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果:A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞平板克隆形成能力相比均減低(P<0.05);A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞平板克隆形成能力無明顯差異(P>0.05)。
　　4. Transwell結(jié)果顯示:A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞侵襲、遷移能力相比均顯著下降(P<0.05),A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞的侵襲、遷移能力無

8、明顯差異(P>0.05)。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞相比凋亡率明顯增高(P<0.05);A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞凋亡率無顯著差異性(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.慢病毒載體介導(dǎo)siRNA能有效沉默人黑色素細(xì)胞瘤A375細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)。
　　2.下調(diào)β-catenin表達(dá)能使人黑色素細(xì)胞瘤A375