rAAV2-TRAIL的構(gòu)建及對惡性黑色素瘤細(xì)胞的凋亡作用.pdf

1、目的:
　　探討腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)介導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因?qū)盒院谏亓黾?xì)胞的凋亡作用。
　　方法:
　　采用PCR方法,以TRAIL質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增出編碼sTRAIL的TRAIL胞外區(qū)片段,將此 TRAIL胞外區(qū)片段插入真核表達(dá)載體

2、,構(gòu)建出穿梭質(zhì)粒pSNAV2.0-sTRAIL,利用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法將擴(kuò)增出的sTRAIL片段插入至腺相關(guān)病毒載體上,構(gòu)建出攜帶有表達(dá) sTRAIL的重組腺相關(guān)病毒rAAV2-sTRAIL。將該病毒體外轉(zhuǎn)染人惡性黑色素瘤細(xì)胞 A375(實(shí)驗(yàn)組)及人胚腎細(xì)胞HEK293(對照組),ELISA、Western blot法檢測目的基因在細(xì)胞中的表達(dá), MTT法檢測其對細(xì)胞增殖的影響,電鏡下觀察及流式細(xì)胞儀檢測rAAV2-sTRAIL

3、對A375的凋亡作用,分析其體外抗人惡性黑色素瘤細(xì)胞的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建出病毒rAAV2-sTRAIL,PCR檢測目的基因條帶正確;Western blot方法可在細(xì)胞內(nèi)檢測出現(xiàn)明顯TRAIL條帶;轉(zhuǎn)染48小時后ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中 TRAIL,HEK293培養(yǎng)基中濃度為190.6±24.1ng/ml,A375培養(yǎng)基中濃度為56.7±12.4ng/ml;MTT法見rAAV2-sTRAIL可對A375增殖