脂蟾毒配基誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、1、研究目的
　　脂蟾毒配基（Resibufogenin，RBG）為強(qiáng)心甾體化合物，化學(xué)名稱為（3β,5β,15β）-14,15-環(huán)氧-3-羥基-5-酜酸丁二酯-20,22-二烯醇化合物，化學(xué)分子式C24H32O4，分子量384.5，白色棱柱狀晶體。由中華大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺的干燥分泌物即蟾酥中分離得到的脂溶性成分蟾毒配基類化合物。文獻(xiàn)報(bào)道RBG具有鎮(zhèn)痛、消炎、麻醉、抗癌、抗輻射、強(qiáng)心等多種藥理活性。目前，藥理活性研究多集中在治

2、療先兆子癇、高血壓及少量抗腫瘤等方面。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道多集中在對(duì)心臟的作用方面，但RBG對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等作用的研究尚未見報(bào)道。本課題采用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和建立肝癌移植瘤動(dòng)物模型等方法，探討和揭示RBG對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的體內(nèi)外抑制作用及其機(jī)制研究，為RBG的新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2、方法
　　2.1RBG對(duì)多種細(xì)胞的MTT及抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖研究以抑制增殖為指標(biāo)，篩選SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞、

3、HepG2、SMMC-7721、SW620、Eca-109、LOVO等6株細(xì)胞為靶細(xì)胞，篩選對(duì)藥物敏感的細(xì)胞株作為本課題的研究對(duì)象，以確定RBG的最佳作用濃度和作用時(shí)間。采用相差顯微鏡、Hoechst33258染色、透射電鏡等方法，觀察不同濃度RBG作用不同時(shí)間后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。PI單染色檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；流式細(xì)胞術(shù)（Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)記）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　2.2RBG對(duì)HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制研究羅丹

4、明123熒光染色測(cè)定線粒體跨膜電位變化；Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt-c、Bcl-2、Bax、Caspase-8，9，3的表達(dá)；通過westernblotting法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p53、PCNA和cyclinB1的表達(dá)。
　　2.3RBG對(duì)裸小鼠HepG2肝癌細(xì)胞移植瘤的作用及其機(jī)制研究以荷瘤鼠為動(dòng)物模型，觀察RBG對(duì)裸鼠HepG2肝癌細(xì)胞移植瘤的作用。采用1×107個(gè)/mLHepG2細(xì)胞接種于

5、BALB/Cnu/nu裸小鼠肢體皮下，建立移植瘤肝癌動(dòng)物模型；10、5和1mg/kgRBG灌胃給藥14d，停藥5d后觀察動(dòng)物的體質(zhì)量變化，動(dòng)物處死后，取瘤體及主要臟器，稱瘤體重量并計(jì)算抑瘤率；心、肝、脾、肺、腎等重要臟器進(jìn)行病理切片、H.E.染色；取各組部分腫瘤組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)；另取各組腫瘤組織，以蛋白印跡法（Westernblot）檢測(cè)其細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt-c、Bcl-2、Bax、

6、Caspase-8，9，3的表達(dá)。以此綜合評(píng)價(jià)RBG對(duì)肝癌的治療效果，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　3、結(jié)果
　　3.1RBG對(duì)細(xì)胞的作用研究表明，在SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞、HepG2、SMMC-7721、SW620、Eca-109、LOVO等6種細(xì)胞中，RBG對(duì)HepG2細(xì)胞的作用最強(qiáng)，對(duì)其抑制增殖作用表現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴性。RBG作用HepG2細(xì)胞48h后，可誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)和周期發(fā)生明顯改變；顯微鏡觀察到，2μmol/L和4

7、μmol/LRBG組及陽性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞密度明顯降低，大部分細(xì)胞體積縮小，亮度減弱，邊緣不清，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，甚至出現(xiàn)溶解性死亡。透射電鏡觀察到細(xì)胞凋亡增多，核縮小，染色質(zhì)致密，呈顆粒狀分布在核膜內(nèi)側(cè)，呈新月狀，后期凋亡細(xì)胞發(fā)生壞死；Hoechst33258染色觀察到，在正常組細(xì)胞中，細(xì)胞核規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)熒光彌散均勻；藥物處理組中，胞核內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀熒光，核固縮、染色質(zhì)凝聚并碎裂。FCM結(jié)果顯示，RBG可誘導(dǎo)HepG2細(xì)

8、胞凋亡。相同時(shí)間（48h）不同濃度和相同濃度（2μmol/L）不同時(shí)間的細(xì)胞周期檢測(cè)顯示：在藥物作用48h和2μmol/LRBG組作用后，細(xì)胞G2/M期比例升高，G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低。
　　3.2RBG抑制HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制以1、2、4μmol/LRBG作用HepG2細(xì)胞48h后，細(xì)胞中線粒體跨膜電位（ψm△）呈濃度依賴性降低，細(xì)胞中抑凋亡蛋白bcl-2表達(dá)降低，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增強(qiáng)；胞漿中的Cyt-c和細(xì)胞

9、中的caspase-9、3的表達(dá)逐漸升高；caspase-8的表達(dá)基本無變化。其中以RBG≥2μmol/L時(shí)，與空白對(duì)照組相比作用顯著。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與G2/M期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白p53、p21、PCNA和CyclinB1發(fā)生改變。提示：RBG可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。
　　3.3RBG對(duì)裸鼠肝癌的治療作用采用皮下接種HepG2細(xì)胞，建立裸鼠移植瘤肝癌模型。接種肝癌HepG2細(xì)胞2周后，模型組動(dòng)物體重明顯

10、減輕，精神狀況欠佳。與模型組相比，經(jīng)10mg/kg、5mg/kgRBG及20mg/kg5-FU治療后，荷瘤小鼠的一般體征有明顯改善，體重下降緩慢，下降程度低于模型組。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)給藥后各臟器未引起炎癥反應(yīng)，且5mg/kg組的療效好于1mg/kg組。免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組瘤組織內(nèi)Bcl-2陽性表達(dá)強(qiáng)度較弱，而Bax蛋白陽性表達(dá)較強(qiáng)，陽性對(duì)照組Bax蛋白表達(dá)未見明顯增強(qiáng)；Westernblot法檢測(cè)結(jié)果顯示與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，抑凋

11、亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞中caspase-9、3的表達(dá)逐漸升高；caspase-8的表達(dá)基本無變化。
　　4、結(jié)論
　　采用熒光染色、透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)、WestenBlot和免疫組織化學(xué)等研究技術(shù)，證實(shí)RBG對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及皮下接種肝癌HepG2細(xì)胞誘發(fā)的腫瘤均具有顯著抑制作用。其可能的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)、降低線粒體跨膜電位、促使線粒體中C