牛黃參含藥血清誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：在細(xì)胞和分子水平探討牛黃參含藥血清（NHS）誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞 HepG2凋亡及其可能的作用機(jī)制，為其在肝癌中的廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。
　　方法：結(jié)合細(xì)胞與血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，對比空白血清、陽性藥CTX、不同濃度組NHS含藥血清對HepG2細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)控基因Cyclin D1、FAS及線粒體膜電位的影響。主要實(shí)驗(yàn)過程如下：
　　1．制備空白對照、CTX及NHS含藥鼠血清，并體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2。<

2、br>　　2.用CCK-8法檢查CTX及0％、5%、10%和20%NHS含藥血清對HepG2細(xì)胞生長抑制率。
　　3．HepG2細(xì)胞給藥48 h后，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　4．HepG2細(xì)胞給藥48 h后，凝膠電泳檢測DNA ladder。
　　5．實(shí)時(shí)定量PCR檢測NHS含藥血清對HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響。
　　6．免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢測

3、NHS含藥血清對HepG2細(xì)FAS抗原表達(dá)的影響。
　　7．流式細(xì)胞術(shù)檢測NHS含藥血清對HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響。
　　結(jié)果：1.成功制備NHS含藥血清，隨著NHS濃度的增加，HepG2細(xì)胞的生長明顯受抑，20%NHS組其細(xì)胞抑制率和CTX組相當(dāng)，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；隨著藥物作用時(shí)間的延長，細(xì)胞生長受抑程度明顯加重。
　　2.采用熒光顯微鏡檢測DAPI染色的兩組細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，20%NHS孵育4

4、8小時(shí)后，HepG2細(xì)胞核染色質(zhì)明顯固縮和碎裂，產(chǎn)生凋亡小體。
　　3．DNA Ladder檢測提示HepG2細(xì)胞加入CTX和不同濃度的NHS后，與空白組相比均有連續(xù)的寡克隆帶或多聚體的形成，濃度5%、10%和20%的NHS含藥血清均具有和CTX基本一致的寡克隆帶形成，表明其具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
　　4．隨著 NHS濃度的逐步增加(5%NHS組、10%NHS組和20%NHS組)，Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水

5、平逐漸下降，而且20%NHS組的表達(dá)量與空白對照組相比，差別具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.免疫組化結(jié)果顯示，與空白對照組相比，除 CTX組的細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒明顯增多外，從5%到20%的NHS含藥血清組，陽性細(xì)胞的比例明顯增高，提示Fas的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。與空白對照HepG2的Fas陽性細(xì)胞數(shù)（1.75±0.34）%相比，不同濃度的NHS含藥血清（5%，10%，20%）孵育48小時(shí)后的Fas陽性細(xì)胞數(shù)分別為（6.54

6、±0.98）%，（13.84±0.72）%和（27.03±2.01）%，與空白對照相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示Fas蛋白表達(dá)升高具有明顯的濃度依賴性，且20%NHS含藥血清組與CTX組相比差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6．NHS作用于HepG2細(xì)胞后48 h，，熒光強(qiáng)度隨著NHS濃度升高而逐漸降低，提示線粒體膜電位水平降低。
　　結(jié)論：NHS含藥血清具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過下調(diào)細(xì)胞