Pim-2基因調(diào)控肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的研究.pdf

1、細(xì)胞死亡有多種方式，但以對(duì)壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)的研究最多。早在1907年Collin在研究神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中曾描述一種不同于壞死的細(xì)胞死亡形態(tài)，50年代Clucksmann總結(jié)了這種死亡形態(tài)的特點(diǎn)，但未被重視。直到60年代．Kerr等Ⅲ將其命名為“固縮性壞死”，為突出其與壞死的不同，于1972年重新命名為凋亡。近年來對(duì)細(xì)胞凋亡的研究越來越多，從單純的形態(tài)學(xué)觀察已深人到分子生物學(xué)水平的研究．細(xì)胞凋亡在外科多

2、種疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中已受到越來越多的關(guān)注。 凋亡誘導(dǎo)基因有p53、Fas、ICE、rpr、Bcl-xs、Bax、Bak、Bad、bid、bik等，凋亡抑制基因有Bc卜2、IAP家族(生存素)、Bcl—x1、Al、Bcl-w、Mcl、BAG一1等，目前研究較多的有p53、Bcl-2、Fas等。在癌基因中，Pim家族的作用得到越來越多的關(guān)注。Pim家族屬于絲蘇氨酸激酶，均為逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的鼠白血病細(xì)胞中的病毒插入片斷。該家族有三個(gè)成

3、員，即Pim-1，2，3。Fox等[2]發(fā)現(xiàn)Pim-2為生長(zhǎng)因子依賴性激酶，即必須在有細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在的條件下才能得到轉(zhuǎn)錄，當(dāng)缺乏某些生長(zhǎng)因子，如IL-3時(shí)，其轉(zhuǎn)錄將被抑制。但如果在細(xì)胞培養(yǎng)體系中撤除所有的生長(zhǎng)因子，此時(shí)加入外源性Pira-2，可使細(xì)胞繼續(xù)存活，并抵抗多種凋亡信號(hào)的作用，因此Pim-2抑制凋亡的作用卻又是非生長(zhǎng)因子依賴性的。 盡管Pim-2最早是作為癌基因被發(fā)現(xiàn)的，但其作用機(jī)制與大多數(shù)癌基因并不一致。Pim一2則

4、僅僅抑制細(xì)胞凋亡，并不促進(jìn)細(xì)胞的增殖。與凋亡抑制蛋白Akt類似，Pim-2表達(dá)的結(jié)果體現(xiàn)在當(dāng)撤除生長(zhǎng)因子后，促進(jìn)細(xì)胞自動(dòng)維持大小形態(tài)、新陳代謝并存活。 肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生中己認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞不僅有增殖和分化異常，同時(shí)還有細(xì)胞凋亡的異常。諸如癌前病變細(xì)胞凋亡機(jī)制受阻，機(jī)體免癥反應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能不全，基因水平上誘導(dǎo)凋亡基因(如p53、bax)的失活以及抑制凋亡基因(如bc卜2)的過分表達(dá)等【引。由于肝細(xì)胞肝癌惡性程度高，目前的治

5、療措施效果均不理想，尤其是對(duì)化療極不敏感，即化療藥物很難誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們推測(cè)，在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，以及對(duì)很多化療藥物的“天然”欠敏感或耐受，也極有可能存在Pim-2的作用。 鑒于此，本研究立足于在離體細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中是被國(guó)際公認(rèn)的替代正常肝細(xì)胞的細(xì)胞株HepG2[4,51，作為我們的研究對(duì)象。人類肝癌細(xì)胞系HepG2來源于人肝細(xì)胞癌組織，與正常肝細(xì)胞在細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)上具有同源性，通過RT-PCR、電泳等技術(shù)證明Pi

6、m一2基因是否在肝癌細(xì)胞HepG2中有表達(dá)，并采用體外RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)干擾HepG2細(xì)胞的Pim一2基因表達(dá)等策略，結(jié)合光鏡、流式細(xì)胞技術(shù)、TUN-EL、AnnexinV／PE雙染法等現(xiàn)代分子技術(shù)，試圖闡明Pim-2在肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用，得出主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論如下： L肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞張氏細(xì)胞在同一條件下培養(yǎng)，含10％胎牛血清的RPMll640和青、

7、鏈霉素培養(yǎng)液中，37℃，C02濃度為5％。培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行RT一PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)HepG2中Pim-2的含量明顯高于張氏細(xì)胞中Pim-2的含量。 2．利用質(zhì)粒載體pGenesil-1構(gòu)建針對(duì)Pim-2基因特異性的帶綠色熒光蛋白的SiRNA質(zhì)粒pPim一2-shRNAA、B、C。將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序證實(shí)SiRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3．將重組質(zhì)粒pPim一2一shRNAA、

8、B、C轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，熒光鏡下觀察其在HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率為85％。將轉(zhuǎn)染了pPim-2-shRNAA、B、C的HepG2細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，再進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pPim-2-shRNAA的Hep62細(xì)胞在48h時(shí)Pim-2的含量最低，故選取轉(zhuǎn)染pPim-2-shRNAA的HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照pPim-2-shRNAC的HepG2細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀、AnnexinV／PE雙染法、TUNEL等方法分析細(xì)