甲胎蛋白調(diào)控肝癌細(xì)胞(HepG2)增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的： 甲胎蛋白（AFP）是哺乳動(dòng)物胎兒的一種主要胞漿蛋白。成人血清中高濃度的AFP與原發(fā)性肝癌和畸胎瘤有關(guān)。因而過(guò)去一直被認(rèn)為是診斷原發(fā)性肝癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，具有早期診斷、鑒別診斷及確立診斷的作用。AFP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的診斷價(jià)值是勿庸置疑的。然而，它不僅僅是單純作為一種伴隨出現(xiàn)的腫瘤特異性蛋白而存在。近年來(lái)，許多科學(xué)家經(jīng)過(guò)反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中不是一種伴隨現(xiàn)象，而是一種與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的內(nèi)源性

2、蛋白。雖然人們已發(fā)現(xiàn)血清中AFP水平的變化與非正常的生長(zhǎng)表型相關(guān)，但它通常被認(rèn)為是一種協(xié)同效應(yīng)，而不是導(dǎo)致表型改變的因素。至今為止，我們?nèi)圆荒芸隙ˋFP是否為出生缺陷與腫瘤發(fā)生中導(dǎo)致生長(zhǎng)表型改變的直接因素。AFP在肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用或者效應(yīng)尚不清楚。此研究的目的即分析AFP的相關(guān)功能，檢測(cè)其調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的能力，并探討其涉及的可能機(jī)制。 方法： 在本研究中，我們利用生物信息技術(shù)設(shè)計(jì)了一種以AFP為靶位的shRNA。在

3、化學(xué)合成shRNA的cDNA雙鏈后構(gòu)建入質(zhì)粒重組表達(dá)載體與重組腺病毒載體中，利用其進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)特異性AFPsiRNA。鑒于需要研究長(zhǎng)期AFP基因的抑制效果，我們通過(guò)質(zhì)粒重組表達(dá)載體系統(tǒng)建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化AFPsiRNA的細(xì)胞系。我們應(yīng)用這些載體抑制AFP在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)Western blot與半定量RT-PCR分析確定了AFPsiRNA的高效性與特異性。為確定AFP靜默對(duì)于HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，我們應(yīng)用軟瓊脂克隆形成

4、實(shí)驗(yàn)與生長(zhǎng)曲線分析方法進(jìn)行細(xì)胞表型研究。同時(shí)，我們應(yīng)用表達(dá)AFPsiRNA的重組腺病毒Adv-AFPsiRNA進(jìn)行HepG2移植裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。而后，為探討導(dǎo)致HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的相關(guān)機(jī)制，我們應(yīng)用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的改變。最后，我們?yōu)榇_定哪些相關(guān)基因受到AFP靜默影響參與這種細(xì)胞周期停滯效應(yīng)，利用cDNA芯片技術(shù)分析了AFP表達(dá)降低的HepG2細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化并進(jìn)行了半定量RT-PCR

5、驗(yàn)證。 結(jié)果： 1．Western blot結(jié)果表明在pCDNA3．1/AFP+pENTR/U6/AFPsiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)后，與空白對(duì)照（pCDNA3．1/AFP+pCDNA3．1）和陰性對(duì)照（pCDNA3．1/AFP+pENTR/U6/LacZsiRNA）相比，AFP的表達(dá)水平有了顯著的下降，蛋白表達(dá)抑制率達(dá)到90%。用重組Adv-AFPsiRNA感染HepG2細(xì)胞48小時(shí)后，通過(guò)western

6、 blot檢測(cè)，AFP的表達(dá)水平呈明顯而特異性的降低，蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)75%。而與之相對(duì)應(yīng)的，Adv-LacZsiRNA對(duì)于AFP的表達(dá)水平則沒(méi)有明顯的影響。利用半定量RT-PCR方法驗(yàn)證AFPsiRNA對(duì)于AFP在mRNA水平上的干擾作用。結(jié)果顯示，在內(nèi)參β-actin表達(dá)量相對(duì)一致的情況下，與陰性對(duì)照HepG2（-）相比，HepG2-B5細(xì)胞內(nèi)AFPmRNA水平明顯降低，抑制率達(dá)92%。 2．通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)感染

7、AFPsiRNA重組腺病毒的HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)與對(duì)照組比較降低了85%。在生長(zhǎng)曲線分析中，pSilencer2．1-U6neo/AFPsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞（HepG2-B5）與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)速度呈明顯下降趨勢(shì)。在HepG2移植裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中，Adv-AFPsiRNA注射組的腫瘤生長(zhǎng)與對(duì)照組相比受到明顯的抑制（p<0．001）。 3．TUNEL原位凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示在Adv-AFPsiRNA感染細(xì)胞

8、中未呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，Adv-LacZsiRNA感染細(xì)胞和未處理細(xì)胞也沒(méi)有明顯細(xì)胞凋亡。與之相比，用已知可引起細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥物一鬼臼毒素（VM-26）（0．09mg/ml）處理48小時(shí)的HepG2細(xì)胞則多數(shù)呈現(xiàn)明顯的凋亡。而HepG2細(xì)胞（HepG2-B5）與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)速度呈明顯下降趨勢(shì)。在HepG2移植裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中獲得的腫瘤經(jīng)切片制備并HE染色，鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的組織學(xué)差異。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析的結(jié)

9、果顯示在加入血清24小時(shí)后，處于G0/G1期的HepG2-B5和HepG2（-）細(xì)胞比例分別是7%（p=0．385）和64070（p=0．004）。這提示HepG2-B5細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期的比例下降。 4．應(yīng)用cDNA芯片技術(shù)并經(jīng)過(guò)半定量RT-PCR的驗(yàn)證，我們篩選出一些基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖相關(guān)基因，如cyclin D1、EBAG9、CDC34、SKP2、CSK等。 結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明