ZNF580在TGF-β1調(diào)控肝癌細(xì)胞HepG2凋亡中的作用研究.pdf

1、目的:以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞株為體外模型，觀察外源性轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1作用下人肝癌細(xì)胞的存活以及凋亡情況、人C2H2型鋅脂蛋白基因ZNF580表達(dá)情況，分析在ZNF580基因過表達(dá)和siRNA干擾ZNF580表達(dá)狀態(tài)下與TGF-β1共同調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因，人胱天蛋白酶-3（Human Caspase-3，Caspase-3）、Bax、B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B celllymphoma/leukemia-2，Bcl-2)表達(dá)量的

2、改變以及細(xì)胞凋亡的變化情況。
　　 方法:
　　 1、培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞接種到六孔板中在各孔內(nèi)加TGF-β1不同濃度、不同時(shí)間提取細(xì)胞RNA和蛋白，每組設(shè)三個(gè)平行孔，RT-PCR及western blot鑒定外源性TGF-β1作用下ZNF580基因表達(dá)的時(shí)間、劑量曲線，以確定TGF-β1誘導(dǎo)的最佳濃度及作用時(shí)間。
　　 2、運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ZNF580及其對照質(zhì)粒pEGFP-C

3、1、siRNA干擾質(zhì)粒PGPU6/GFP/Neo-ZNF580-491及其對應(yīng)錯(cuò)義質(zhì)粒PGPU6/GFP/Neo-UC分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并觀察轉(zhuǎn)染效率，流式細(xì)胞術(shù)分選純化轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，RT-PCR以及western blot鑒定ZNF-580基因表達(dá)量。
　　 3、以確定的TGF-β1最佳濃度和時(shí)間處理轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，RT-PCR以及western blot檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax基因的表達(dá)變化，熒光雙染技術(shù)、流

4、式細(xì)胞術(shù)觀察在TGF-β1誘導(dǎo)下細(xì)胞的凋亡變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度TGF-β1作用HepG2細(xì)胞后，當(dāng)濃度為4 ng/ml時(shí)ZNF580基因表達(dá)達(dá)到最低值(P＜0.05);4 ng/ml的TGF-β1作用HepG2細(xì)胞，ZNF580基因表達(dá)量在12h達(dá)到最低值(P＜0.05)。
　　 2.pEGFP-ZNF580、PGPU6/GFP/Neo-ZNF580-491質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞ZNF580基因表

5、達(dá)與原始株有差異(P＜0.05)。成功實(shí)現(xiàn)了ZNF580基因在HepG2細(xì)胞中的過表達(dá)和低表達(dá)。
　　 3.熒光雙染、流式細(xì)胞術(shù)可見加入外源性TGF-β1后ZNF580過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率降低、ZNF580低表達(dá)組細(xì)胞凋亡率升高。
　　 4.RT-PCR及western blot鑒定Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量的變化，Bax及Caspase-3基因在ZNF580基因過表達(dá)時(shí)表達(dá)量降低，加入TGF-β1刺激后