siRNA沉默Livin基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖與凋亡的影響.pdf

1、背景與目的:肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，該疾病發(fā)病率的趨勢(shì)逐年增高，手術(shù)切除仍然是治療肝癌最有效的方法。許多基因的參與與肝癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有著密切的關(guān)聯(lián)，在肝癌的不同發(fā)展時(shí)期均有基因的參與及調(diào)控。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是存在于真核生物體內(nèi)的一種阻斷外源基因表達(dá)的自我防御體系。由雙鏈RNA介導(dǎo)，能夠特異性的使細(xì)胞內(nèi)與其互補(bǔ)的單鏈RNA發(fā)生降解。近年來，國內(nèi)外報(bào)道了一系列通過RNAi特異性抑制肝癌發(fā)病相

2、關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)，為肝癌研究及靶向治療帶來新希望和新啟示。Livin又稱KIAP(kidneyinhibitor of apoptosis protein)、ML-IAP(melanoma inhibitor of apoptosis protein),是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，最近研究表明，Livin基因在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞株HepG2中Livin基因的

3、表達(dá)，觀察Livin基因?qū)Ω伟┘?xì)胞HepG2的增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響，并探討其相關(guān)作用機(jī)制，為以Livin基因?yàn)榘悬c(diǎn)肝癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:將攜帶Livin基因的siRNA載體轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Livin基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)改變。流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)和TUNEL檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞周期與凋亡的變化。采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，以(x)±s來表示實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料測(cè)定結(jié)果，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法中的方差分析以及t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.肝癌HepG2細(xì)胞中l(wèi)ivin基因處于高表達(dá)狀態(tài)，其對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。
　　 2.轉(zhuǎn)染攜帶livin基因的siRNA后，RT-PCR結(jié)果顯示，livin基因的mRNA表達(dá)水平明顯下降，相對(duì)于對(duì)照組與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.轉(zhuǎn)

5、染攜帶livin基因的siRNA后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，livin基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下降，相對(duì)于對(duì)照組與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.轉(zhuǎn)染攜帶livin基因的siRNA后，F(xiàn)CM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白組肝癌細(xì)胞HepG2在G1期所占比例及細(xì)胞早期凋亡率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.轉(zhuǎn)染攜帶livin基因的siRNA后，TUNEL技術(shù)檢測(cè)表明實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞HepG2凋亡數(shù)目明顯增加，