靶向沉默甲胎蛋白表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞功能學(xué)的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建靶向沉默甲胎蛋白的慢病毒載體并評(píng)價(jià)沉默效果。探討沉默甲胎蛋白表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞功能學(xué)方面的影響，為后續(xù)對(duì)肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移方面實(shí)驗(yàn)研究建立細(xì)胞模型。
　　方法：采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建靶向沉默AFP基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量，再用嘌呤霉素篩選純化以獲得穩(wěn)定沉默甲胎蛋白的細(xì)胞系。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組肝癌細(xì)胞中AFP的mRNA表達(dá)水平；

2、Western blotting檢測(cè)沉默后AFP的蛋白表達(dá)水平變化；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組肝癌細(xì)胞的增殖情況；運(yùn)用Tranwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力；Wound Healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果：沉默組AFP在mRNA水平較空白組下降約90％（P＜0.05），在蛋白表達(dá)水平下降（62.53±6.17）%（P＜0.05）；MTT法結(jié)果顯示沉默組細(xì)胞培養(yǎng)6天后，細(xì)胞增值率下降（31.17±1.16）%（P＜0.

3、05）；Transwell實(shí)驗(yàn)沉默組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)較空白組和陰性組降低明顯，依次為(174.80±16.20)個(gè)、(315.25±19.70)個(gè)、(304.60±20.30)個(gè)，（P＜0.05）；Wound Healing實(shí)驗(yàn)48h后，沉默組遷移率較空白組和陰性組明顯下降，分別為(29.96±6.79)%、(54.77±9.24)%、(49.04±8.31)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:靶向沉默AFP的慢病毒載