Cks1、Cks2對(duì)人類肝癌細(xì)胞系HepG2增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　研究CKs1、CKs2對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控的影響，探究肝細(xì)胞癌致病機(jī)理，為肝細(xì)胞癌臨床治療提供新的線索。
　　方法：
　　1、設(shè)計(jì)并合成分別針對(duì)Cks1、Cks2基因的SiRNA序列，以脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2，干擾目的基因的表達(dá)；
　　2、構(gòu)建分別針對(duì)Cks1、Cks2基因的pcDNA3.1/Hygro-IRES2-EGFP質(zhì)粒載體，使用脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株

2、HepG2，增強(qiáng)目的基因的表達(dá)，建立過(guò)表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；
　　3、轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞，應(yīng)用real-time PCR分別檢測(cè)Cks1、Cks2mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用western blot分別檢測(cè)Cks1、Cks2蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　4、運(yùn)用CCK-8和細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)干擾和增強(qiáng)后細(xì)胞的增殖情況；
　　5、應(yīng)用Annexin-V/PI雙染細(xì)胞，以順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)分析干擾和增強(qiáng)后細(xì)胞凋亡情況。
　　6、

3、使用PI染色，流式細(xì)胞術(shù)分析干擾和增強(qiáng)后細(xì)胞周期變化。
　　7、選取若干個(gè)與細(xì)胞生存、增殖密切相關(guān)的蛋白質(zhì)——Akt、GSK-3β、Bcl-2，在目的基因干擾后進(jìn)行western blot檢測(cè)，觀察蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1、RNA干擾后24-96小時(shí)，Cks1、Cks2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，蛋白水平以轉(zhuǎn)染后48小時(shí)干擾效果最佳。
　　2、篩選出Cks1、Cks2過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系。
　

4、　3、CCK-8和細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)顯示：干擾細(xì)胞內(nèi)源性Cks蛋白之后，HepG2細(xì)胞的增殖速度減慢；而過(guò)表達(dá)Cks蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　4、細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)結(jié)果顯示：HepG2細(xì)胞的凋亡率隨著 Cks蛋白表達(dá)的下調(diào)而增高；Cks蛋白表達(dá)水平的升高，使細(xì)胞凋亡率減少。
　　5、周期實(shí)驗(yàn)分析表明：過(guò)表達(dá)Cks1，能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期。
　　6、Akt、GSK-3β蛋白的磷酸化部分pAkt、pGSK