槲寄生多糖分離純化及對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)作為一種惡性腫瘤，極易復(fù)發(fā)且死亡率高。目前普遍認(rèn)可醫(yī)治肝癌的臨床方法是手術(shù)和化療，但效果并不理想，肝癌導(dǎo)致的死亡率仍然居高不下。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一類傳染性疾病，最終可發(fā)展為肝硬化甚至是肝癌。目前治療HBV的藥物價(jià)格昂貴，而且在治療的同時(shí)損傷了機(jī)體免疫力。因此開發(fā)一種天然無毒、能夠殺傷腫瘤細(xì)胞且增加機(jī)體免疫功能的抗腫瘤及抗病毒功能性食品和藥物是

2、當(dāng)今研究的重點(diǎn)。
　　槲寄生(Viscum coloratum(Kom.)Nakai)是一種具有多種生物學(xué)活性的藥用植物，其活性成分例如生物堿、多糖也被證明具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化和抗感染等作用。本研究從槲寄生莖枝中分離純化得到三種槲寄生多糖級分，并對其抗病毒及抗腫瘤活性機(jī)制進(jìn)行研究，通過蛋白質(zhì)組學(xué)及生物學(xué)信息學(xué)技術(shù)分析多糖作用下差異表達(dá)蛋白參與的代謝通路及相互作用關(guān)系。本研究的主要內(nèi)容如下:
　　(1)本研究利用

3、水提醇沉方法從槲寄生莖枝中提取出一種槲寄生粗多糖，經(jīng)DEAE-纖維素分離純化后得到三種槲寄生多糖級分，命名為VCP1，VCP2和VCP3。SepharoseCL-6B凝膠過濾層析測定分子量，HPLC法分析單糖組成，VCP1分子量為32 KDa，由Glc(30.6％),Gal(34.3％),Ara(14.9％),Rha(1.7％),Man(18.5％)組成;VCP2分子量為280 KDa，由Glc(8.4％)，Gal(14.5％)，Ara

4、(43.2％)，Rha(6.3％)，Man(7.0％)，GlcA(1.8％)，GalA(18.8％)組成;VCP3分子量為21KDa，由Glc(5.6％),Gal(10.5％),Ara(33.3％),Rha(13.8％),Man(4.4％)，GlcA(1.3％)，GalA(31.1％)組成。紫外光譜顯示多糖級分中不含蛋白質(zhì)和核酸。VCP1，VCP2和VCP3的旋光度分別為-0.163、1.234和0.395，比旋光度分別為-2.040、

5、40.726和65.833。紅外光譜(FT-IR)和核磁共振譜(NMR)檢測三種多糖級分的結(jié)構(gòu)，VCP2的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步用甲基化法表征。三種多糖級分都具有糖類物質(zhì)特征吸收峰，VCP1為中性多糖，VCP2和VCP3為RG-Ⅰ型果膠。VCP2主要由GalA、Rha、Gal和Ara組成，GalA和Rha分別以α-1，4-GalA和α-1，2-Rha的形式連接構(gòu)成主鏈，Ara和Gal則分別以阿拉伯聚糖和半乳聚糖的形式連接在Rha上形成側(cè)鏈。VCP2

6、中的GalA被高度甲酯化，酯化度約為50％，幾乎沒有乙酰化。
　　(2)經(jīng)CCK-8法測定槲寄生多糖三種級分能夠抑制HepG2.2.15細(xì)胞增殖，其中VCP2活性最強(qiáng)。FQ-PCR法檢測VCP2能抑制HBV-DNA的復(fù)制，ELISA法檢測VCP2對病毒HBsAg和HBeAg的分泌有直接抑制作用，且都呈現(xiàn)濃度依賴性，但作用均顯著低于陽性對照Lami。因此，可以開發(fā)槲寄生多糖級分作為抗HBV的輔助治療藥物，提高療效。
　　(3)

7、槲寄生多糖三種級分通過CCK-8法檢測均能夠?qū)epG2細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用，呈現(xiàn)濃度依懶性，尤其是VCP2。槲寄生多糖級分VCP2能阻滯細(xì)胞周期于G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖;且VCP2能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。qRT-PCR和Western blot進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)槲寄生多糖通過上調(diào)p21和CyclinD基因表達(dá)，而使CyclinE和CDK4表達(dá)下調(diào)，從而阻滯細(xì)胞周期于G1期，抑制HepG2細(xì)胞增殖;另外，VCP2能上調(diào)Smac和Caspa

8、ses-3基因，抑制抗凋亡基因Bcl-XL和XIAP表達(dá)，從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，此過程中Bad作用并不明顯(p＜0.05)。
　　(4)通過iTRAQ技術(shù)聯(lián)合LC-MSMS鑒定HepG2細(xì)胞和VCP2作用48 h的HepG2細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白為113種，其中59種蛋白表達(dá)上調(diào)，54種蛋白表達(dá)下調(diào)。GO富集得到差異顯著的條目(p＜0.05)分別為:生物學(xué)過程1355項(xiàng)，細(xì)胞成分186項(xiàng)，分子功能218項(xiàng)。而KEGG通路富集到2