miR-21靶向調(diào)控MAP2K3的表達及其對肝癌細胞HepG2增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建能夠高效抑制成熟miR-21小分子表達的腺病毒載體,探討其對肝癌細胞株HepG2生長的影響,以期闡述miR-21在腫瘤形成過程中的分子機制,為臨床肝癌治療提供參考數(shù)據(jù)和新的思路。
　　方法：(1)根據(jù)人miR-21基因序列(MIMAT0000077),采用miRNAsponge技術(shù)合成一段含有與miR-21序列完全互補的8個重復片段(miR-21S),克隆至穿梭載體pAdTrack-CMV中,經(jīng)雙酶切及測序鑒定;與pAd

2、Easy-1腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組,PacI線性化后利用脂質(zhì)體將重組表達載體轉(zhuǎn)染到293A細胞包裝并大量擴增攜帶miR-21S基因的重組腺病毒(Ad/miR-21/inhibitor),測定病毒滴度。(2)運用miRanda、Targetscan和PicTar等靶基因預測軟件檢索miR-21(microRNA-21)可能的靶基因,篩選出保守程度高、結(jié)合自由能低,并且與癌癥相關(guān)的基因作為候選靶基因,通過預測,我們選定MAP2K3為研究的靶

3、基因,然后構(gòu)建螢火蟲熒光素酶表達載體,在293T細胞中驗證miR-21與MAP2K3之間的關(guān)系。將MAP2K3的3'UTR亞克隆至pMIR-Report質(zhì)粒熒光素酶報告基因下游,使之能表達融合靶基因3'UTR的重組熒光素酶,將pMIR-Report/MAP2K3重組質(zhì)粒和pAd/pri-miR-21表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染293T細胞,48h后收集細胞,采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),以海腎熒光素酶作為參照,進行熒光素酶檢測。同時采用

4、點突變的方法使MAP2K3-3'UTR中與miR-21的結(jié)合位點堿基突變,構(gòu)建突變質(zhì)粒pMIR-Report/Mut-MAP2K3,檢測其抑制作用是否消失。(3)用制備的Ad/miR-21/inhibitor、Ad/pri-miR-21及Ad/con腺病毒感染HepG2細胞,感染48h后,收集細胞,分別提取microRNAs和總蛋白,通過Real-TimePCR和WesternBlot分別檢測miR-21和MAP2K3表達水平。(4)用

5、Ad/miR-21/inhibitor腺病毒感染HepG2細胞,分別于24、48、72h后終止刺激,采用MTT法檢測細胞的增殖水平,Hochest染色及BCL-2表達檢測細胞的凋亡水平。(5)收集寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院2006年到2012年手術(shù)切除的肝癌組織及癌旁組織14例,免疫組化檢測MAP2K3在肝癌及癌旁組織中的表達水平,研究MAP2K3在肝癌中的作用。
　　結(jié)果：生物信息學分析結(jié)果顯示miR-21和MAP2K3存在可能的結(jié)合位

6、點,且MAP2K3在肝細胞性肝癌組織中低表達,在癌旁組織中表達升高,因此可被認作新的肝癌抑癌基因。通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實了miR-21靶向結(jié)合MAP2K33’UTR的保守位點抑制其表達;Westernblot分析結(jié)果顯示,過表達miR-21后MAP2K3蛋白質(zhì)表達降低了3/5(P<0.05),抑制miR-21表達后MAP2K3蛋白質(zhì)表達增加1.8倍。結(jié)果表明,miR-21可以靶向作用MAP2K33’UTR抑制MAP2K3蛋白質(zhì)的

7、表達。經(jīng)PCR、酶切、測序及GFP表達證實成功地構(gòu)建了攜帶miR-21S基因的重組腺病毒載體并制備出高滴度重組病毒。重組的Ad/miR-21/inhibitor腺病毒可有效抑制HepG2細胞的增殖能力并促進其凋亡,起到了抑制腫瘤生長的效果。
　　結(jié)論：成功制備人Ad/miR-21/inhibitor重組腺病毒,進一步證實miR-21可以負向調(diào)節(jié)靶基因MAP2K3的表達并在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。為今后開展以microRNA-