miR-21調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、舌鱗狀細(xì)胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma，TSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，約占口腔惡性腫瘤的43.4％。舌鱗狀細(xì)胞癌常造成患者的語(yǔ)言、進(jìn)食等功能障礙及顏面部的畸形，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。舌鱗癌常常發(fā)生早期頸淋巴轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高。近二十年來，盡管臨床上舌鱗癌的綜合治療已經(jīng)很普遍，但以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療對(duì)舌鱗癌生存率的提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在50％～55％左右，并沒有顯著提高

2、，中晚期患者的5年生存率更低，約為27％，而且這些方法都存在各自的局限性，特別是對(duì)中晚期和復(fù)發(fā)患者療效不佳，對(duì)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者療效更差。因此，尋找更安全有效的治療途徑是提高舌鱗狀細(xì)胞癌生存率和生存質(zhì)量所亟待解決的難題。 大量的研究已經(jīng)證實(shí)，人類疾病的發(fā)生發(fā)展直接和間接地與基因密切相關(guān)，因此，可以認(rèn)為人類的疾病都是基因病。所以從本質(zhì)上來說，舌鱗狀細(xì)胞癌也是一種基因病，與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和凋亡失控等密切相關(guān)。從理論上講，基因治療有望解決

3、這些問題，所以惡性腫瘤的基因治療是近十幾年來的研究熱點(diǎn)。但長(zhǎng)期以來人們一直不遺余力地尋找某一基因和某一疾病的對(duì)應(yīng)關(guān)系，由于概念與技術(shù)的局限，把這種尋找變成了一對(duì)一的簡(jiǎn)單線性關(guān)系的研究，有“零敲碎打”之嫌，致使目前基因治療的效果不盡人意。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)編碼基因的改變，只是單純抑制某個(gè)基因的表達(dá)，難以有效地起到抑癌作用?？上驳氖?，人類基因組計(jì)劃已于2003年4月完成全部序列測(cè)定，進(jìn)入了后基因組時(shí)代即功能基因組學(xué)時(shí)代，基因組科學(xué)完

4、成了一次歷史性轉(zhuǎn)折，而疾病基因組學(xué)也不斷取得成果，在觀念和技術(shù)上，初步實(shí)現(xiàn)了由“零敲碎打”向“整體闡明”的轉(zhuǎn)折。 舌鱗癌細(xì)胞與其它惡性腫瘤一樣，其生物學(xué)特性取決于其特異表達(dá)的基因，而在腫瘤發(fā)展過程中必然伴隨著不同的基因表達(dá)變化。那么，調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞特異的基因表達(dá)及其發(fā)展過程中基因表達(dá)變化的生物學(xué)機(jī)制是什么？對(duì)于這一問題，雖然目前還沒有確切的答案，但是，近年非編碼RNA(non—codingRNAs)，特別是微小分子RNA(mic

5、roRNA，miRNA)調(diào)控基因表達(dá)研究的興起給回答該問題提供了新的線索。內(nèi)源性miRNA可調(diào)控?cái)?shù)十到數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)，因此，腫瘤細(xì)胞內(nèi)起到“促癌”和“抑癌”作用的非編碼miRNA比編碼的癌基因和抑癌基因少得多，可以成為更穩(wěn)定有效的抗癌靶點(diǎn)。 miRNAs的研究分析提示，miRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡、細(xì)胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生。在眾多相關(guān)疾病中，惡性腫瘤的miRNA表達(dá)異常最受矚目。根

6、據(jù)高通量的miRNA微陣列和實(shí)時(shí)定量RT—PCR(quantitativereal—timePCR，qRT—PCR)分析，發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的miRNA表達(dá)譜與它們來源的正常組織存在很大區(qū)別，這種區(qū)別在低分化和惡性程度高的腫瘤組織表現(xiàn)得更顯著些。在某些惡性腫瘤中，miRNA含量比來源的正常組織明顯降低，腫瘤分化越差，miRNA的含量也越低，如在乳腺痛組織中，miR-10b、l

7、et—7、miR-125b和miR-145等的表達(dá)明顯下調(diào)。而某些miRNA在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)卻有所上升，如乳腺癌中的miR—21和miR-155。惡性腫瘤miRNA表達(dá)的變化說明腫瘤細(xì)胞基因調(diào)控機(jī)制發(fā)生改變，與cDNA微陣列比較，miRNA表達(dá)譜能為癌腫的分子分期和分型提供更準(zhǔn)確的信息。 隨著新的miRNA的不斷發(fā)現(xiàn)及其功能的逐漸明確，使得miRNA的研究倍受關(guān)注，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。大量研究發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中表達(dá)異常的miR

8、NA的靶基因?qū)儆诎┗蚧蛘咭职┗颍@些靶基因都與細(xì)胞的增殖、凋亡或分化密切相關(guān)。正是因?yàn)閙iRNA具有調(diào)節(jié)癌基因或者抑癌基因表達(dá)的功能，故其自身也充當(dāng)著“抑癌基因”和“癌基因”的角色。然而在頭頸腫瘤，特別是以舌鱗癌為代表的口腔鱗狀細(xì)胞癌中相關(guān)miRNA及其功能的研究未見報(bào)道。本研究采用高通量的miRNA微陣列篩選出不同分期的舌鱗癌組織和癌旁正常組織中差異表達(dá)的內(nèi)源性miRNA，獲得舌鱗癌細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜；選取在早期和中晚期舌鱗癌

9、中都顯著高表達(dá)的miR-21為進(jìn)一步研究對(duì)象，通過qRT-PCR驗(yàn)證其在50例不同分期舌鱗癌組織中的差異表達(dá)；同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)miR-21靶基因原肌球蛋白1(tropomyosin-1，TPM-1)在同樣50例舌鱗癌組織中的表達(dá)，并用Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)合患者的臨床資料統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，建立體外培養(yǎng)舌鱗癌細(xì)胞模型，檢測(cè)miR-21在細(xì)胞中的表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)染miR-21拮抗物和TPM-

10、1siRNA對(duì)其調(diào)控功能進(jìn)行分析研究。為闡明miRNA調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的生物學(xué)機(jī)制提供新線索，以期為研制靶向舌鱗癌細(xì)胞的miRNA或其靶基因的新型基因藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分舌鱗癌組織和癌旁正常組織miRNA差異表達(dá)分析 目前研究miRNA表達(dá)的方法有克隆測(cè)序、RNA印跡以及RNA酶保護(hù)分析(RNAaseprotectionassay，RPA)。但對(duì)于腫瘤研究，非常需要大規(guī)模比較腫瘤組織和正常組織中的m

11、iRNAs表達(dá)譜差異，以上的方法耗時(shí)耗力，檢測(cè)的通量不高。而基于熒光標(biāo)記的基因芯片技術(shù)(Microarraytechnology)提供了大量檢測(cè)多種miRNAs表達(dá)的平臺(tái)。這一技術(shù)可以有效快捷地同時(shí)比較大量miRNAs表達(dá)變化情況，已在諸多實(shí)驗(yàn)室被用于miRNAs的研究。RNA印跡和RT-PCR技術(shù)雖然是低通量的檢測(cè)技術(shù)，但芯片檢測(cè)的結(jié)果仍需要它們進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)成熟miRNA的PCR方法是最近才發(fā)展起來的方法，它是驗(yàn)證miRNA芯片數(shù)據(jù)

12、或檢測(cè)單個(gè)miRNA表達(dá)的高靈敏度的方法。 本部分研究應(yīng)用miRNA微陣列技術(shù)，初步分析舌鱗癌組織和癌旁正常組織miRNA表達(dá)譜的差異和不同分期的舌鱗癌miRNA表達(dá)譜變化。選取在早期和中晚期舌鱗癌中都顯著高表達(dá)的miR-21為進(jìn)一步研究對(duì)象，通過qRT-PCR驗(yàn)證其在50例不同分期舌鱗癌組織中的差異表達(dá)。 研究結(jié)果顯示： 1.舌鱗癌組織和癌旁正常舌黏膜組織中存在差異表達(dá)的miRNA分子。從總體上看，晚期舌鱗癌組

13、miRNA分子表達(dá)差異較大，早期組差異相對(duì)較小。 2.在早期舌鱗癌組中，與正常舌黏膜相比具有表達(dá)變化的miRNA分子有25個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的有10個(gè)(miR-16，miR—21，miR—31，…)，下調(diào)表達(dá)的有15個(gè)(miR—26b，miR-148a，miR-198，…). 3.在晚期舌鱗癌組中，與正常舌黏膜相比具有表達(dá)變化的miRNA分子有28個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的有26個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有2個(gè)(miR—23a，miR—26a

14、)。 第二部分miR—21、TPM-1和細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系及臨床意義 一些實(shí)驗(yàn)和臨床研究證據(jù)都顯示，miRNAs可以作為一類新的腫瘤癌基因或者腫瘤抑制基因。當(dāng)這些miRNAs的表達(dá)在腫瘤中增高的時(shí)候，就被看作癌基因，它們通過促進(jìn)腫瘤增殖或者抑制腫瘤抑制基因，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多miRNAs在不同的腫瘤中過度表達(dá)，它們都作為原癌基因促進(jìn)腫瘤增殖，但是只有其中少數(shù)部分的功能研究得比較清楚。有學(xué)者對(duì)多

15、種腫瘤中都表達(dá)升高的miRNAs進(jìn)行歸納，發(fā)現(xiàn)miR—21在幾種腫瘤中都是表達(dá)升高的。近年來，許多學(xué)者對(duì)TPM-1的組成結(jié)構(gòu)及與多種腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了研究，普遍認(rèn)為TPM-1作為一個(gè)抑癌基因有可能成為一種新的腫瘤標(biāo)記物。國(guó)外的一項(xiàng)研究提示TPM-1是miR—21的一個(gè)靶基因，下調(diào)miR—21可提高TPM-1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。 為了解miR—21、TPM-1表達(dá)與舌鱗癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)mi

16、R—21靶基因TPM-1在同樣50例舌鱗癌組織中的表達(dá)，并用Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex，AI)，結(jié)合患者的臨床資料統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系。 第三部分miR—21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控 隨著越來越多的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)，人們的研究焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到miRNAs的功能研究。miR—21作為人類細(xì)胞或組織中發(fā)現(xiàn)較早的、存在較為廣泛的miRNA，在人類miRNAs的功能研究中發(fā)揮

17、了不容忽視的作用。目前有多種研究miRNAs與所預(yù)測(cè)靶基因關(guān)系的方法得到了大家的認(rèn)可，如采用報(bào)告基因載體法，通過對(duì)報(bào)告基因表達(dá)水平的檢測(cè)估計(jì)miRNA與靶序列的結(jié)合情況，另一個(gè)重要的方法是功能缺失試驗(yàn)，即用2’—羥基甲基化的反義寡核苷酸(ASO)阻斷miRNA的功能。最為直接的證據(jù)仍然是借助于ASO的功能缺失試驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)通過建立體外培養(yǎng)舌鱗癌細(xì)胞模型，檢測(cè)miR—21在舌鱗癌細(xì)胞株SCC-15和CAL27中的表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)染m