siRNA表達質(zhì)粒抑制人舌鱗癌細胞hTERT表達的體外實驗研究.pdf

1、背景和目的：隨著人類基因組計劃的完成，現(xiàn)代基因治療學快速發(fā)展。利用RNA干擾(RNAi，RNAinterference)原理的knockdown技術(shù)在人類基因功能研究方面有著高效、特異、安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢。RNAi已成為近年來基礎(chǔ)研究的熱點，并在諸多惡性腫瘤研究中取得進展。 端粒酶在85％以上的惡性腫瘤細胞中陽性表達，而在正常體細胞一般為陰性。隨著對惡性腫瘤發(fā)病機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生的先決條件。把端粒酶作為

2、腫瘤治療的靶點具有良好的應用前景。目前研究認為端粒酶復合體主要由人端粒酶RNA(hTR，humantelomeraseRNA)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT，humantelomerasereversetranscriptase)組成，其余的蛋白和它們相連，并促進折疊和裝配。端粒DNA的合成必須以hTR為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄合成。最近研究報道hTERT既是影響端粒酶活性的最重要部分，也是端粒酶活性的限速組分，它在80-90％的腫瘤細胞中表達

3、，因此，靶向hTERT顯然更為理想。 本實驗作為課題組的前期摸索實驗，旨在驗證利用RNAi技術(shù)，針對端粒酶的hTERTmRNA干擾舌癌細胞的hTERT表達是否有效，以期從中選擇最有效的小干擾RNA(siRNA，smallinterferenceRNA)為下一步的深入研究作準備，以便探討siRNA表達載體作為舌癌基因治療新策略的可行性。 方法：1、根據(jù)Genbank提供的基因序列，按照Tuschl設(shè)計原則，利用計算機輔助設(shè)

4、計軟件，針對hTERTmRNA設(shè)計三組理論可能有效siRNA，利用基因克隆技術(shù)將其載入質(zhì)粒載體pGPU6，得到三組重組質(zhì)粒P1718、P1813、P3057，通過雙酶切鑒定和DNA測序鑒定；同時設(shè)立一非特異性對照組Pcontrol。 2、采用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染法，分別將四組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Tca8113細胞，同時設(shè)立空白對照，48h后采用RT-PCR對轉(zhuǎn)染后的細胞內(nèi)hTERTmRNA表

5、達情況作半定量分析，Westernblot定性分析細胞內(nèi)hTERT蛋白的表達變化情況。 結(jié)果：1、經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測序鑒定，證實成功構(gòu)建了三組siRNA質(zhì)粒載體P1718，P1813，P3057，和一組非特異性的重組質(zhì)粒Pcontrol。 2、四組siRNA重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染細胞48h后，P1718，P3057，Pcontrol組的細胞mRNA表達均無明顯變化，而P1813組的mRNA表達下調(diào)明顯，平均抑制率為52％；