siRNA靶向抑制CPB2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞TAFI表達(dá)及生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移性影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害患者生命健康?；颊咴诎┌Y早期即可發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移，不利于乳腺癌的有效控制和治療，因此乳腺癌的抗轉(zhuǎn)移治療成為研究的熱點(diǎn)。
　　 凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)是一種新發(fā)現(xiàn)的主要由肝臟分泌的具有血漿羧肽酶樣活性的單鏈糖蛋白。TAFI被凝血酶、纖溶酶及凝血酶-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物(T-TM)等激活形成活化TAFI(TAFIa)， TAFIa可以降解部分水解的纖維蛋白C末端的賴(lài)氨酸殘基，抑

2、制纖溶酶的活化，高濃度TAFIa還可以直接抑制纖溶酶的活性，進(jìn)一步下調(diào)纖溶系統(tǒng)的活性，與臨床心、腦血管性疾病，腫瘤等許多疾病具有密切聯(lián)系。TAFI濃度受編碼基因羧肽酶B2(CPB2)控制，CPB2定位于13q14.11，TAFI mRNA翻譯合成由423個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，包括22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，92個(gè)氨基酸組成的活性肽和309個(gè)氨基酸組成的活性催化域。
　　 本研究以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系為研究對(duì)象，利用RN

3、A干擾技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)小于擾RNA（siRNA），使其靶向抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中CPB2基因的表達(dá)，檢測(cè)RNA干擾后乳腺癌細(xì)胞中TAFI表達(dá)水平；并探討TAFI對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響；研究腫瘤與凝血、纖溶系統(tǒng)的關(guān)系；結(jié)合相關(guān)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新思路。
　　 方法：
　　 1．復(fù)蘇，培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳代；
　　 2．設(shè)計(jì)并化學(xué)合成編碼TAFI基因(CPB2

4、)的3條候選特異性siRNA和1條非特異性siRNA，將細(xì)胞分為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組5組，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中；
　　 3．RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后5組MDA-MB-231細(xì)胞中TAFI mRNA的表達(dá)；
　　 4．采用Western Blot的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后5組MDA-MB-231細(xì)胞中TAFI蛋白表達(dá)；
　　 5．經(jīng)過(guò)RT-PC

5、R和Western Blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果篩選出抑制率最高的siRNA，進(jìn)一步進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組進(jìn)行比較；
　　 6．四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1．將細(xì)胞分5組成功轉(zhuǎn)染后，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA-1組，siRNA-2組，s

6、iRNA-3組與陰性對(duì)照組比較，TAFI mRNA表達(dá)水平顯著下降；
　　 2．Western Blot檢測(cè)5組細(xì)胞TAFI蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)siRNA-1組，siRNA-2組，siRNA-3組與陰性對(duì)照組比較，TAFI蛋白表達(dá)水平顯著下降，3個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染組的抑制率分別為(55.4±4.9)％，(55.0±0.6)％，（42.6±3.5）％；
　　 3. RT-PCR和Western Blot篩選出siRNA-3為抑制

7、率最高的siRNA， Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力較陰性對(duì)照組明顯降低；
　　 4．MTT實(shí)驗(yàn)顯示TAFI表達(dá)受抑制的siRNA-3組細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，存活率降低。
　　 結(jié)論:
　　 1．RNAi技術(shù)成功抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中TAFI的表達(dá)，使得乳腺癌細(xì)胞TAFI mRNA和TAFI蛋白含量明顯降低，尤其是 siRNA-3組的抑制作用最顯著，故篩選出siRNA-