SiRNA靶向沉默EGFR基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建靶向人EGFR基因的RNAi慢病毒載體并體外轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1，觀察抑制效果。探討慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默EGFR基因在胰腺癌基因治療中的應(yīng)用前景，以開(kāi)辟胰腺癌治療的新途徑。
　　 方法：
　　 1．構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體LV-shEGFR，陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。
　　 2．用LV-shEGFR與pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝與純化產(chǎn)

2、生慢病毒顆粒及病毒滴度測(cè)定。
　　 3．將獲得的病毒感染胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1細(xì)胞，用Real-timePCR及Western-blot檢測(cè)細(xì)胞中EGFR基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為Panc-1組(空白組)、GFP-Panc-1組(對(duì)照組)及SiEGFR-Panc-1組(干擾組)共三組。
　　 4．采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀(FCM)分析細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡，探討攜帶目的基因病毒轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌

3、細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.LV-shEGFR的克隆測(cè)序得到正確的結(jié)果，陽(yáng)性克隆鑒定測(cè)序結(jié)果如下：CGCAAAGTGTGTAACGGAATA插入片斷位于95-115bp。
　　 2．大量包裝與純化后病毒滴度為2×108TU/ml。
　　 3.Real-timePCR檢測(cè)慢病毒感染Panc-1后EGFR基因沉默效果，干擾組抑制率達(dá)80％;Westem blot法檢測(cè)顯示，干擾組靶細(xì)胞EG

4、FR蛋白表達(dá)抑制明顯，蛋白條帶明顯變細(xì)、變淺，相對(duì)表達(dá)量顯著下降。
　　 4．干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯慢于空白及GFP組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。三組細(xì)胞經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，干擾組凋亡率為(18.4±2.29)%明顯高于GFP對(duì)照組(7.36±1.38)%和空白組(7.72±1.15)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干擾組使細(xì)胞G2／M期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)比例增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。