siRNA沉默COX-2基因?qū)θ艘认侔┘?xì)胞的生長(zhǎng)和成瘤能力的影響.pdf

1、胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是消化系統(tǒng)中較常見的惡性腫瘤之一，且近年來(lái)全球胰腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在眾多實(shí)體瘤中，胰腺癌預(yù)后最差。隨著分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)等相關(guān)學(xué)科的深入研究，胰腺癌的基因治療被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)療法之后的腫瘤治療的新模式。
　　 環(huán)氧合酶-2(COX-2)是花生四烯酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，包括胰腺癌在內(nèi)的許多腫瘤和癌前病變組織中高表達(dá)，并參與調(diào)控其發(fā)生發(fā)展過(guò)程。COX-2在腫瘤細(xì)胞生

2、成、凋亡、血管生成方面起重要作用，因此，從理論上認(rèn)為它是治療胰腺癌較好的分子靶點(diǎn)。大量的實(shí)驗(yàn)證明阻滯COX-2的表達(dá)對(duì)治療胰腺癌有良好的效果。
　　 RNA干擾(Ribonucleic acid interference，RNAi)是一種通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)從而沉默基因表達(dá)的方法，其主要在21-25nt的小RNA(Small interfering ribonucleic acid，siRNA)反義鏈的介導(dǎo)下，識(shí)別并靶向切割同源性mR

3、NA而發(fā)生沉默后轉(zhuǎn)錄。人工合成的siRNA已成為研究基因沉默后功能的一種重要工具，siRNA能高效、特異的抑制靶基因的表達(dá)，它的這種特點(diǎn)使其在包括胰腺癌在內(nèi)的許多難以治療的疾病中應(yīng)用前景廣闊。
　　 研究目的:
　　 1.研究siRNA沉默COX-2基因后對(duì)COX-2在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)的影響。
　　 2.研究siRNA沉默COX-2基因后對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 3.研究siRNA沉

4、默COX-2基因后對(duì)胰腺癌細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力的影響。
　　 材料和方法:
　　 主要材料:
　　 1.人胰腺癌Capan-2細(xì)胞株。
　　 2.COX-2-siRNA序列：
　　 siRNA001：靶序列：GCTGGGAAGCCTTCTCTAA。正義鏈：(5'-3')GCUGG GAAGCCUUCUCUAAdTdT。反義鏈：(3'-5')dTdTCGACCCUUCGGAAGAGAUU。

5、　　 siRNA002：靶序列：GCAGCTTCCTGATTCAAAT。正義鏈：(5'-3')：GCAGC UUCCUGAUUCAAAU dTdT。反義鏈：(3'-5')dTdTCGUCGAAGGACUAAGUUUA。
　　 siRNA003：靶序列：GAATCATTCACCAGGCAAA。正義鏈：(5'-3')GAAUCA UUCACCAGGCAAAdTdT。反義鏈：(3'-5')dTdTCUUAGUAAGUGGUCCGUU

6、U。
　　 siRNA004：靶序列：AACACCGGAATTTTTGACAAG。正義鏈：(5'-3')AACACCGGAAUUUUUGACAAGdTdT。反義鏈：(3'-5')dTdTUUGUGGCCUUAAAAACUGUUC。
　　 siRNA005：靶序列：GATTGAAGATTATGTGCAA。正義鏈：(5'-3')GAUUG AAGAUUAUGUGCAAdTdT。反義鏈：(3'-5')dTd TCUAACUUC

7、UAAUACACGUU。
　　 siRNA006：靶序列：GGACTTATGGGTAATGTTA。正義鏈：(5'-3')GGACUU AUGGGUAAUGUUAdTdT。反義鏈：(3'-5')dTdTCCUGAAUACCCAUUAC AAU。
　　 3.RT-PCR引物：COX-2 primer：Left primer：TTCAAATGAGATTGTGGG AAAAT，Right primer：AGATCATCTCTGC

8、CTGAGTATCTT。β-actin primer：Left primer：AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC，Right primer：CTACAATGAGC TGCGTGTGG。
　　 4.Realtime-PCR引物：COX-2 primer：Left primer：CTGGAACATGGAATT ACCCAGTTTG，Right primer：TGGAACATTCCTACCACCAGCA。β-actin prim

9、er：Left primer：TGGCACCCAGCACAATGAA，Right primer：CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA。
　　 5.轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基：Opti-MEM I。轉(zhuǎn)染載體：Lipofectamine 2000(Lipo)。
　　 6.一抗：COX-2(WB濃度：1∶1000)，β-actin(WB濃度：1∶5000)。
　　 7.BALB/C裸鼠。
　　 方法：

10、>　　 1.Capan-2細(xì)胞株應(yīng)用RPMI 1640培養(yǎng)基(添加10％胎牛血清，但不添加抗生素)，置于含5％C02，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2.應(yīng)用熒光標(biāo)記的siRNA(cy3-siRNA)和lipo進(jìn)行轉(zhuǎn)染率的篩選實(shí)驗(yàn)。
　　 3.應(yīng)用Trizol提取總RNA，RIPA提取總蛋白。
　　 4.RT-PCR、Realtime-PCR進(jìn)行COX-2-siRNA有效序列的篩選，以β-actin為內(nèi)參照。

11、
　　 5.Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中COX-2蛋白的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照。
　　 6.應(yīng)用細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)有效COX-2-siRNA對(duì)Capan-2細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 7.裸鼠皮下接種COX-2-siRNA轉(zhuǎn)染后Capan-2細(xì)胞，6周后評(píng)估有效COX-2-siRNA對(duì)Capan-2細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

12、：計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-X)±s)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，所有數(shù)據(jù)均在計(jì)算機(jī)SPSS13.0軟件包上進(jìn)行。
　　 結(jié)果：
　　 1. Lipo與siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度的篩選應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑在同一優(yōu)化條件下，Capan-2細(xì)胞可成功轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率達(dá)96.47％。篩選siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度為50nm,Lipo最佳轉(zhuǎn)染劑量為5μl/2ml轉(zhuǎn)染體積中。
　　 2.COX-2-siRNA沉默Capan-2細(xì)胞中C

13、OX-2基因表達(dá)的最佳序列的篩選。
　　 SiRNA006有最佳的沉默COX-2基因的作用，與空白對(duì)照組相比，沉默效果明顯(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)以后沉默效率達(dá)到73％。其COX-2蛋白表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)分別被下調(diào)了67％和61％(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染后24小時(shí)抑制不明顯，lipo對(duì)照組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 3.COX-2-siRNA沉默COX-2基因?qū)ap

14、an-2細(xì)胞的生長(zhǎng)、周期和凋亡的影響。
　　 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，與空白對(duì)照組相比，COX-2-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢(P＜0.05)，48小時(shí)和72小時(shí)抑制細(xì)胞增殖率分別為35.48％和56.32％。同時(shí)細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組高(P＜0.05)，48小時(shí)和72小時(shí)細(xì)胞早期凋亡率為2.03％和3.27％。轉(zhuǎn)染24小時(shí)以后，與空白對(duì)照組相比，COX-2-siRNA轉(zhuǎn)染組G0/G1期的細(xì)胞比例升高(P＜0.05)，24小時(shí)、48小

15、時(shí)和72小時(shí)G0/G1期的比值分別是58.03％、63.31％和65.66％。S期細(xì)胞比例下降(P＜0.05)， 24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)S期的比值分別是30.27％、24.87％和22.2％。
　　 4.COX-2-siRNA沉默COX-2基因?qū)apan-2細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力的影響。
　　 每只裸鼠均可見腫瘤生長(zhǎng)，與空白對(duì)照組相比，COX-2-siRNA轉(zhuǎn)染組裸鼠的皮下腫瘤體積和重量較小(P＜0.05)，分別

16、為50mm3和54.7mg。
　　 結(jié)論:
　　 1.COX-2-siRNA可有效的沉默COX-2 mRNA的表達(dá)。
　　 2.COX-2-siRNA可下調(diào)COX-2蛋白水平的表達(dá)。
　　 3.COX-2-siRNA可在一定程度上抑制Capan-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，使較多的細(xì)胞停留在G0/G1期，而進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，可在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。
　　 4.COX-2-siRNA能在一定程