siRNA沉默livin基因?qū)ξ赴┘毎L及其凋亡的影響.pdf

1、背景和目的: 胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已處中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機，只能進行保守治療，而保守治療的效果往往不能令人滿意，其原因是多方面的，但腫瘤細胞凋亡機制異常引起的凋亡抵抗被認為是對化療、放療藥物不敏感的重要因素，因此從凋亡異常的發(fā)生機制著手，尋找逆轉(zhuǎn)胃癌細胞凋亡抵抗的靶點將會成為胃癌治療的新的研究方向。有研究表明，凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IA

2、P）家族是獨立于Bcl-2的細胞內(nèi)抗凋亡蛋白家族，包括多種蛋白，其中l(wèi)ivin是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制基因成員，它們在凋亡的調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色。研究表明，腫瘤細胞中的IAP表達往往上調(diào)，通過阻斷或拮抗IAP的功能重新恢復惡性腫瘤（包括胃癌）對凋亡刺激劑（包括化療藥物）的敏感性，因此如果能夠抑制livin基因在腫瘤細胞中的表達，將會恢復腫瘤細胞對凋亡的敏感性，大大提高腫瘤的治療效果。目前國內(nèi)外關于Livin的研究較少，且有資料顯示L

3、ivin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，Livin基因在胃癌的中所扮演的角色國內(nèi)外研究亦不多，值得我們深入研究。 RNAi（RNA interference）技術(shù)是近年發(fā)展起來的基因沉默技術(shù)，能夠利用雙鏈RNA（dSRNA）特異性地降解與其同源的mRNA序列，阻斷相應基因的表達。并且能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，產(chǎn)生類似基因敲除的效應。因此探討小干擾RNA（siRNA）對胃癌細胞livin基因表達

4、的基因沉默（gene silencing）作用，有望為胃癌的治療提供一種新的思路和方法。為此，本研究通過自行設計了靶向沉默Livin的siRNA真核表達載體，轉(zhuǎn)染至胃癌細胞株BCG-823中來抑制Livin的表達，然后檢測轉(zhuǎn)染前后胃癌BCG-828細胞的增值能力及凋亡敏感性的變化，觀察siRNA對胃癌BGC-823細胞株livin基因的表達影響，以探討siRNA在腫瘤細胞生長、凋亡中的作用，為探索siRNA沉默livin基因抑制胃癌的發(fā)

5、病機制和臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。 方法: 1.利用Takara、Ambion和PromegasiRNA靶序列分析設計系統(tǒng)，掃描人livin（livinα和livinβ）cDNA編碼序列，依據(jù)siRNA靶序列設計原則，經(jīng)BLAST同源性分析選擇確定19個堿基的siRNA靶序列，同時隨機組合出一條對照序列。設計并化學合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向livin基因的寡核苷酸，再退火，克隆到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的

6、siRNA表達載體啟動子的下游，重組構(gòu)建RNAi質(zhì)粒同時設立非特異性對照，干擾載體用限制性核酸內(nèi)切酶酶切和測序鑒定。 2.脂質(zhì)體介導siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞株BGC-823后用G418篩選建立穩(wěn)定細胞系；觀察細胞形態(tài)，采用半定量RT-PCR檢測不同實驗組細胞BGC-823 mRNA水平，比較不同組別的mRNA水平。 3.用四氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞增殖凋亡；熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細胞數(shù)，并計算其轉(zhuǎn)

7、染綠。 結(jié)果: 1.通過同源序列檢索和進一步優(yōu)選，確定了19個堿基為siRNA靶序列：GCGTCTGGCCTCCTTCTAT（440～458）和GTCTGGCCTCCTTCTATGA（442～460）。 2.siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見明亮條帶，均位于約100bp處，與設計完全一致。 3.對胃癌細胞株BGC-823真核表達載體的構(gòu)建進行酶切和序列分析，發(fā)現(xiàn)酶切圖譜及插入序列與預期結(jié)果一致。

8、 4.轉(zhuǎn)染siRNA組Livinα/βmRNA（0.11±0.07，0.13±0.04）表達明顯低于空白對照組（0.37±0.10，0.43±0.09和空siRNA載體組（0.34±0.08，0.45±0.11， P<0.05）。 5.空白對照組與空siRNA載體組相比，24h、48h、96h和1周時細胞生長未受影響；siRNA組在轉(zhuǎn)染后24h和48h細胞生長也未受影響，但在96h和1周時則被明顯抑制（P<0.01）。

9、 6.轉(zhuǎn)染siRNA組的細胞的凋亡率（14.85±1.35）明顯高于空白對照組（4.51±0.36）和轉(zhuǎn)染空siRNA載體組（5.13±0.71），兩組差異有顯著性（P<0.05）。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建出針對livin的siRNA表達載體。 2.靶向siRNA表達載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞后能顯著降低livin基因的表達。 3.Livin基因與腫瘤細胞的增殖和凋亡密切相關，siRNA沉默livin基因能抑制胃癌細