沉默Livin基因誘導食管癌細胞凋亡的研究.pdf

1、第一部分Livin基因在不同人食管癌細胞株及食管上皮細胞株中的表達及意義
　　目的：檢測Livin基因在食管上皮細胞株及不同食管癌細胞株中的表達情況，并篩選出高表達Livin的食管癌細胞株，為后續(xù)實驗做準備。
　　方法：分別采用實時定量PCR(qRT-PCR)和Western blot從mRNA水平和蛋白水平檢測 Eca-109、TE-1、 EC9706三種食管癌細胞株及食管上皮細胞株HEEC中Livin的表達情況。

2、　　結(jié)果：qRT-PCR及Western blot顯示，在食管上皮細胞株HEEC中 Livin mRNA和蛋白的表達明顯低于三種食管癌細胞株(P<0.05)；qRT-PCR顯示，在上述三種食管癌細胞株中，Livin mRNA均有高表達。在 Eca-109細胞株中， Livin mRNA表達水平最高，且與 TE-1和EC9706細胞株中 Livin mRNA表達水平均存在著顯著性差異(P<0.01)。TE-1與 EC9706之間 Livi

3、n mRNA表達水平無明顯區(qū)別(P>0.05)；Western blot結(jié)果提示，Livin在上述三種食管癌細胞株中蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：在食管癌細胞株中 Livin的表達顯著增高；Livin在Eca-109食管癌細胞株中的表達高于TE-1、 EC9706食管癌細胞株。通過篩選Eca-109細胞株可用于后續(xù)實驗研究。
　　第二部分Livin和VEGF在食管癌組織中的表達與臨床分期的相關(guān)性分析

4、r>　　目的：檢測不同臨床分期食管癌患者癌組織中，Livin與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，探討Livin和VEGF在食管癌組織中的表達與臨床分期的相關(guān)性。
　　方法：使用蛋白質(zhì)免疫印跡法、免疫組織化學法和RT-PCR檢測癌組織Livin，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法和RT-PCR檢測癌組織VEGF。
　　結(jié)果：隨著食管癌的演進，食管癌組織中Livin和VEGF的表達逐漸增高，以臨床Ⅳ期中的表達增高最為顯著(P<0.01)，V

5、EGF與 Livin表達具有顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論：Livin和VEGF參與了食管癌的演進，可能成為治療食管癌的有效靶點之一。
　　第三部分靶向Livin的RNA干擾對食管癌凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達的影響
　　目的：探討靶向 Livin的 RNA干擾對食管癌凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的影響。
　　方法：采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染 Livin高表達的食管癌 Eca-10

6、9細胞株，從而有效地進行靶向Livin的RNA干擾。將Eca-109細胞分為正常對照組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染組。分別采用實時熒光定量 PCR和Western blot檢測各組細胞中Livin、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達情況。
　　結(jié)果：經(jīng)過靶向Livin的RNA干擾后，實驗組細胞中Livin基因mRNA表達水平較空白對照組和陰性組明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；而與促進細胞凋亡相關(guān)的 Ca

7、spase-3、Caspase-9 mRNA表達水平較均較空白對照組和陰性組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果也提示，經(jīng)過靶向Livin RNA干擾后，實驗組細胞中 Livin基因蛋白表達水平較空白對照組和陰性組明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；而與促進細胞凋亡相關(guān)的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平較均較空白對照組和陰性組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0

8、.01)。
　　結(jié)論：針對Livin的RNA干擾可有效降低Livin高表達的食管癌Eca-109細胞株中Livin mRNA和蛋白水平。同時，與細胞凋亡相關(guān)的信號分子Caspase-3和Caspase-9 mRNA和蛋白水平均明顯升高。該研究提示，針對 Livin的 RNA干擾可有效升高 Caspase-3和 Caspase-9的表達，從而促進食管癌細胞的凋亡。
　　第四部分RNA干擾Livin聯(lián)合順鉑對食管癌細胞Eca-1

9、09增殖和凋亡的影響
　　目的:探討RNA干擾Livin聯(lián)合順鉑對食管癌細胞增殖和凋亡的影響及相關(guān)作用機制。
　　方法：首先構(gòu)建病毒載體，采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染Livin高表達的食管癌 Eca-109細胞株，并聯(lián)合順鉑進行干預。轉(zhuǎn)染后，用分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-9在405 nm外時吸光度值；XTT檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖情況；采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡；TUNEL檢測細胞凋亡形態(tài)改變；電鏡下觀察凋亡

10、細胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染后，分光光度法提示 Eca-109細胞株中 Caspase-3、Caspase-9表達明顯增強(P<0.01)；XTT結(jié)果顯示，Eca-109細胞株存活率明顯降低(P<0.01)；RNA干擾聯(lián)合順鉑干預的 Eca-109較單純順鉑干預的細胞明顯減少(P<0.01)；細胞周期和凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng) RNA干擾后，細胞周期主要被阻滯于S期；而相于單純順鉑干預，RNA干擾聯(lián)合順鉑可明顯增加阻滯于S期的細胞數(shù)