食管癌細(xì)胞中fascin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制初步研究.pdf

1、陜西師范大學(xué)碩士學(xué)位論文食管癌細(xì)胞中fascin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制初步研究姓名：郭張燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：楊章民200705015 、以p B F ．1 4 3 5 為模板進(jìn)行嵌套缺失試驗(yàn)，獲得系列缺失子，測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的缺失子和對(duì)照質(zhì)粒p G L B 、內(nèi)參照質(zhì)粒p R L T K 一同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染E C l 0 9 細(xì)胞，培養(yǎng)4 8 - ' J 、時(shí)后裂解細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。6

2、、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3 8 7 b p 區(qū)段內(nèi)存在哪些潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。7 、以p B F ．3 8 7 為模板，用P C R 及酶切的方法構(gòu)建元件( S P l 、C R E B 、T A T Ab o x ) 缺失表達(dá)載體，測(cè)序。8 、以空載體p G L B 為對(duì)照，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒p R L - T K一同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染E C l 0 9 細(xì)胞，培養(yǎng)4 8 小時(shí)后裂解細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果

3、分析。結(jié)果和結(jié)論：1 、以食管癌細(xì)胞系E C l 0 9 全基因組D N A 為模板，成功擴(kuò)增出f a s c i n 基因5 ’側(cè)翼區(qū)3 k b 片段，測(cè)序結(jié)果與G e n B a n k q b 注冊(cè)的J k f a s c i n 基因# 圣．N C B I ／B L A S T 比對(duì)，證明確為f a s c i n 基因，除四個(gè)堿基不同外，相似度達(dá)到9 9 ．9 ％。2 、以p T F - 2 9 0 0 為模板P C R 分段

4、擴(kuò)增f a s c i n 基因5 ’側(cè)翼區(qū)依次截短約5 0 0 b p 的四條片斷，測(cè)序結(jié)果經(jīng)N C B I ／B L A S T ，證明擴(kuò)增結(jié)果正確，與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度吻合。3 、成功構(gòu)建螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體p B F ．2 9 0 0 - - 4 3 6 。4 、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢澳1 ] p B F ．2 9 0 0 - 4 3 6 在E C l 0 9 細(xì)胞中啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)活性，結(jié)果表B 羽f a s c i

5、 n 基因在E C l 0 9 細(xì)胞中確有顯著的啟動(dòng)子活性，且啟動(dòng)子區(qū)至少位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游4 3 6 b p 內(nèi)。5 、通過(guò)嵌套缺失所得缺失子測(cè)序，表明成功獲取系列缺失子質(zhì)粒p B F ·1 4 3 5 - + 8 2 。6 、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系列缺失子在E C l 0 9 細(xì)胞中啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)活性，結(jié)果分析確定f a s c i n 基因核心啟動(dòng)子區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3 1 6 b p到2 2 b p

6、的區(qū)段內(nèi)。7 、應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)軟件A l i B a b a 2 ．1 分析預(yù)$ Y f a s c i n 5 ’側(cè)翼．3 8 7 區(qū)段內(nèi)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，總共發(fā)現(xiàn)5 6 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中包含多個(gè)S P l 結(jié)合位點(diǎn)，在靠近T A T A 框處存在一段D N A 序列，可同時(shí)結(jié)合C R E B 、C ／E B P a l p h a 、A T F 、C R E -B P l 、e - J u n 等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。8 、成功構(gòu)