HLA-DR調(diào)控巨噬細(xì)胞在哈薩克族食管癌浸潤轉(zhuǎn)移中作用與機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開論述：
　　第一部分：巨噬細(xì)胞在哈族食管鱗癌組織的分布特征及其臨床病理學(xué)意義
　　目的：探討不同亞型的巨噬細(xì)胞和表型分子與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白在哈族食管鱗癌組織中的表達(dá)、分布特征及其與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法：（1）收集哈族食管鱗癌和癌旁正常組織280例，制備白片和組織芯片；（2）應(yīng)用免疫組化法進(jìn)行CD68，HLA-DR雙染和CD163染色，分別檢測M1和M2型巨噬細(xì)胞在哈族食管鱗癌組

2、織中的分布，并分析其與食管鱗癌患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。(3)以CD34和D2-40為標(biāo)記檢測微血管和淋巴管在食管鱗癌組織中的分布；應(yīng)用免疫組化法檢測HLA-DR、浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF和MMP9的表達(dá)情況及其臨床病理學(xué)意義；（4）綜合分析哈族食管鱗癌組織中巨噬細(xì)胞的密度與HLA-DR、VEGF和MMP-9的表達(dá)及微血管和淋巴管的密度之間的相關(guān)性；
　　結(jié)果：（1）M1和M2型巨噬細(xì)胞分布于食管鱗癌的癌巢和癌周間質(zhì)中，癌周間質(zhì)中

3、巨噬細(xì)胞密度明顯高于癌巢；哈族食管鱗癌組織癌巢和間質(zhì)中M1、M2型巨噬細(xì)胞的密度明顯高于癌旁正常組織（癌巢中M1型密度：3.28±2.23vs1.04±0.86，間質(zhì)M1型密度：11.67±5.8vs6.41±2.05；癌巢中M2型密度：13.18±11.24vs1.73±1.73,間質(zhì)M2型密度：55.21±25.71vs20.90±9.60；P均<0.001），哈族食管鱗癌組織中M2/M1巨噬細(xì)胞的比值同樣明顯高于癌旁正常組織（癌巢

4、：4.96±4.47vs1.57±1.67；間質(zhì)：6.44±5.81vs3.53±1.75；P均<0.001）；（2）結(jié)合臨床病理參數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)間質(zhì)中M1型巨噬細(xì)胞密度與食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯的負(fù)相關(guān)（P<0.05），而癌巢和間質(zhì)中M2型巨噬細(xì)胞密度和M2/M1比值與哈族食管鱗癌患者脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈明顯正相關(guān)（P均<0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)M2/M1巨噬細(xì)胞比值在食管鱗癌間質(zhì)中還與腫瘤的浸潤深度呈明顯的正相關(guān)（P<0.

5、05）；間質(zhì)中高密度的M2型巨噬細(xì)胞和高M(jìn)2/M1比值預(yù)示食管鱗癌患者較差的預(yù)后（P<0.05)；Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的密度與患者不良預(yù)后密切相關(guān)（P<0.05），可以作為哈族食管鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。（3）巨噬細(xì)胞是HLA-DR重要的表達(dá)組成細(xì)胞之一，食管鱗癌組織中HLA-DR表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，但與哈族食管鱗癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈明顯的負(fù)相關(guān)（P<0.05）；哈族食管鱗癌組織VEGF和MMP9

6、的表達(dá)及微血管和淋巴管的分布數(shù)量明顯高于癌旁正常組織，且與哈族食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)（P均<0.05）；（4）結(jié)合M2巨噬細(xì)胞的在食管鱗癌的分布特點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)間質(zhì)中的M2型巨噬細(xì)胞及M2/M1的比值與HLA-DR的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，與微血管、淋巴管的分布、VEGF和MMP9的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（P均<0.05）；
　　結(jié)論：（1）M2型巨噬細(xì)胞的增加與哈薩克族食管癌組織中微血管、淋巴管的密度以及患者脈管浸潤、淋巴結(jié)

7、轉(zhuǎn)移和臨床分期呈明顯正相關(guān)，高密度的M2型巨噬細(xì)胞可能是哈族食管鱗癌高侵襲性和不良預(yù)后的重要參考指標(biāo)；（2）M2型巨噬細(xì)胞密度的增高與表型分子HLA-DR表達(dá)的降低及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白VEGF和MMP9的過表達(dá)呈正相關(guān)，提示這些分子可能參與哈族食管癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程。
　　第二部分：HLA-DR介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對食管癌生物學(xué)行為的影響及機(jī)制初探
　　目的：探討HLA-DR介導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其初步

8、作用機(jī)制。
　　方法：（1）利用Transwell小室將巨噬細(xì)胞與食管鱗癌細(xì)胞非接觸性共培養(yǎng)，通過免疫熒光、實(shí)時(shí)定量qRT-PCR法檢測共培養(yǎng)前后巨噬細(xì)胞的表型（CD163,HLA-DR/CD68,HLA-DR,TNF-a,IL-10)的改變，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察共培養(yǎng)前后腫瘤細(xì)胞形態(tài)的變化；（2）采用qRT-PCR和westernblot檢測共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF和MMP9表達(dá)的變化；應(yīng)用CCK8、集落克隆形成

9、實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測巨噬細(xì)胞對食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響；（3）慢病毒shRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)巨噬細(xì)胞中HLA-DR的表達(dá)，應(yīng)用免疫熒光、qRT-PCR和westernblot檢測轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞表型的改變；qRT-PCR和westernblot檢測下調(diào)HLA-DR的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF和MMP9表達(dá)的變化；應(yīng)用CCK8增殖、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測下調(diào)HLA-DR的巨噬細(xì)

10、胞對食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：（1）食管鱗癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，免疫熒光顯示CD163陽性巨噬細(xì)胞（M2型）數(shù)目明顯增多，CD68/HLA-DR雙染（M1型）巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯減少；qRT-PCR檢測同樣顯示巨噬細(xì)胞M2表型標(biāo)記IL-10表達(dá)明顯增高，而M1表型標(biāo)記HLA-DR和TNF-a表達(dá)明顯降低（P<0.05）；westernblot檢測從蛋白水平也證實(shí)了共培養(yǎng)后M2表型巨噬細(xì)胞的增多；（2

11、）共培養(yǎng)后多數(shù)食管鱗癌細(xì)胞由圓形上皮特性變?yōu)樗笮伍g葉細(xì)胞特性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞中MMP9和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）；CCK8增殖和集落克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示食管鱗癌細(xì)胞增殖活性與對照組相比明顯降低（P<0.05）；Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示共培養(yǎng)后食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯增加（P均<0.05）；（3）干擾下調(diào)巨噬細(xì)胞中HLA-DR的表達(dá)后，巨噬細(xì)胞中HLA-DR、TNF-a的表達(dá)明顯下調(diào)

12、，IL-10表達(dá)明顯升高（P均<0.05），顯示更多巨噬細(xì)胞向M2表型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；（4）共培養(yǎng)體系中下調(diào)HLA-DR的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的MMP9和VEGF明顯增多（P均<0.05）；下調(diào)HLA-DR的巨噬細(xì)胞與食管鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，食管鱗癌細(xì)胞增殖能力明顯提高，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯增加（P均<0.05）。
　　結(jié)論：（1）巨噬細(xì)胞與食管癌細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)了M2型巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和食管癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，HLA-DR具有促