HLA-DR調控巨噬細胞在哈薩克族食管癌浸潤轉移中作用與機制的初步研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開論述：
　　第一部分：巨噬細胞在哈族食管鱗癌組織的分布特征及其臨床病理學意義
　　目的：探討不同亞型的巨噬細胞和表型分子與侵襲轉移相關蛋白在哈族食管鱗癌組織中的表達、分布特征及其與臨床病理特征、預后的相關性。
　　方法：（1）收集哈族食管鱗癌和癌旁正常組織280例，制備白片和組織芯片；（2）應用免疫組化法進行CD68，HLA-DR雙染和CD163染色，分別檢測M1和M2型巨噬細胞在哈族食管鱗癌組

2、織中的分布，并分析其與食管鱗癌患者臨床病理及預后的關系。(3)以CD34和D2-40為標記檢測微血管和淋巴管在食管鱗癌組織中的分布；應用免疫組化法檢測HLA-DR、浸潤轉移相關基因VEGF和MMP9的表達情況及其臨床病理學意義；（4）綜合分析哈族食管鱗癌組織中巨噬細胞的密度與HLA-DR、VEGF和MMP-9的表達及微血管和淋巴管的密度之間的相關性；
　　結果：（1）M1和M2型巨噬細胞分布于食管鱗癌的癌巢和癌周間質中，癌周間質中

3、巨噬細胞密度明顯高于癌巢；哈族食管鱗癌組織癌巢和間質中M1、M2型巨噬細胞的密度明顯高于癌旁正常組織（癌巢中M1型密度：3.28±2.23vs1.04±0.86，間質M1型密度：11.67±5.8vs6.41±2.05；癌巢中M2型密度：13.18±11.24vs1.73±1.73,間質M2型密度：55.21±25.71vs20.90±9.60；P均<0.001），哈族食管鱗癌組織中M2/M1巨噬細胞的比值同樣明顯高于癌旁正常組織（癌巢

4、：4.96±4.47vs1.57±1.67；間質：6.44±5.81vs3.53±1.75；P均<0.001）；（2）結合臨床病理參數，我們發(fā)現(xiàn)間質中M1型巨噬細胞密度與食管鱗癌患者淋巴結轉移呈明顯的負相關（P<0.05），而癌巢和間質中M2型巨噬細胞密度和M2/M1比值與哈族食管鱗癌患者脈管浸潤、淋巴結轉移和臨床分期呈明顯正相關（P均<0.05），同時發(fā)現(xiàn)M2/M1巨噬細胞比值在食管鱗癌間質中還與腫瘤的浸潤深度呈明顯的正相關（P<0.

5、05）；間質中高密度的M2型巨噬細胞和高M2/M1比值預示食管鱗癌患者較差的預后（P<0.05)；Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞的密度與患者不良預后密切相關（P<0.05），可以作為哈族食管鱗癌患者的獨立預后因素。（3）巨噬細胞是HLA-DR重要的表達組成細胞之一，食管鱗癌組織中HLA-DR表達明顯高于癌旁正常組織，但與哈族食管鱗癌的浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期呈明顯的負相關（P<0.05）；哈族食管鱗癌組織VEGF和MMP9

6、的表達及微血管和淋巴管的分布數量明顯高于癌旁正常組織，且與哈族食管鱗癌患者淋巴結轉移和臨床分期呈正相關（P均<0.05）；（4）結合M2巨噬細胞的在食管鱗癌的分布特點，分析發(fā)現(xiàn)間質中的M2型巨噬細胞及M2/M1的比值與HLA-DR的表達呈明顯負相關，與微血管、淋巴管的分布、VEGF和MMP9的表達呈明顯正相關（P均<0.05）；
　　結論：（1）M2型巨噬細胞的增加與哈薩克族食管癌組織中微血管、淋巴管的密度以及患者脈管浸潤、淋巴結

7、轉移和臨床分期呈明顯正相關，高密度的M2型巨噬細胞可能是哈族食管鱗癌高侵襲性和不良預后的重要參考指標；（2）M2型巨噬細胞密度的增高與表型分子HLA-DR表達的降低及侵襲轉移相關蛋白VEGF和MMP9的過表達呈正相關，提示這些分子可能參與哈族食管癌的浸潤和轉移過程。
　　第二部分：HLA-DR介導巨噬細胞對食管癌生物學行為的影響及機制初探
　　目的：探討HLA-DR介導巨噬細胞表型的轉化對食管鱗癌細胞生物學行為的影響及其初步

8、作用機制。
　　方法：（1）利用Transwell小室將巨噬細胞與食管鱗癌細胞非接觸性共培養(yǎng)，通過免疫熒光、實時定量qRT-PCR法檢測共培養(yǎng)前后巨噬細胞的表型（CD163,HLA-DR/CD68,HLA-DR,TNF-a,IL-10)的改變，應用倒置顯微鏡觀察共培養(yǎng)前后腫瘤細胞形態(tài)的變化；（2）采用qRT-PCR和westernblot檢測共培養(yǎng)后巨噬細胞中侵襲轉移相關基因VEGF和MMP9表達的變化；應用CCK8、集落克隆形成

9、實驗、Transwell遷移及侵襲實驗分別檢測巨噬細胞對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響；（3）慢病毒shRNA轉染下調巨噬細胞中HLA-DR的表達，應用免疫熒光、qRT-PCR和westernblot檢測轉染后巨噬細胞表型的改變；qRT-PCR和westernblot檢測下調HLA-DR的巨噬細胞所產生侵襲轉移相關基因VEGF和MMP9表達的變化；應用CCK8增殖、Transwell遷移及侵襲實驗分別檢測下調HLA-DR的巨噬細

10、胞對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。
　　結果：（1）食管鱗癌細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)48h后，免疫熒光顯示CD163陽性巨噬細胞（M2型）數目明顯增多，CD68/HLA-DR雙染（M1型）巨噬細胞數目明顯減少；qRT-PCR檢測同樣顯示巨噬細胞M2表型標記IL-10表達明顯增高，而M1表型標記HLA-DR和TNF-a表達明顯降低（P<0.05）；westernblot檢測從蛋白水平也證實了共培養(yǎng)后M2表型巨噬細胞的增多；（2

11、）共培養(yǎng)后多數食管鱗癌細胞由圓形上皮特性變?yōu)樗笮伍g葉細胞特性，同時發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后巨噬細胞中MMP9和VEGF mRNA和蛋白表達明顯增加（P<0.05）；CCK8增殖和集落克隆形成實驗顯示食管鱗癌細胞增殖活性與對照組相比明顯降低（P<0.05）；Transwell遷移和侵襲實驗顯示共培養(yǎng)后食管鱗癌細胞的遷移和侵襲能力均明顯增加（P均<0.05）；（3）干擾下調巨噬細胞中HLA-DR的表達后，巨噬細胞中HLA-DR、TNF-a的表達明顯下調

12、，IL-10表達明顯升高（P均<0.05），顯示更多巨噬細胞向M2表型巨噬細胞的轉化；（4）共培養(yǎng)體系中下調HLA-DR的巨噬細胞所產生的MMP9和VEGF明顯增多（P均<0.05）；下調HLA-DR的巨噬細胞與食管鱗癌細胞共培養(yǎng)后，食管鱗癌細胞增殖能力明顯提高，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力均明顯增加（P均<0.05）。
　　結論：（1）巨噬細胞與食管癌細胞共培養(yǎng)促進了M2型巨噬細胞表型轉化和食管癌細胞的侵襲與轉移，HLA-DR具有促