食管癌細胞與神經(jīng)相互作用的形態(tài)學(xué)研究以及神經(jīng)周浸潤在食管癌中的意義.pdf

1、【背景】
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞所處的內(nèi)外環(huán)境有密切的關(guān)系。1971年Folkman等首次提出腫瘤能夠促進血管生成,并且生成的血管提供腫瘤生長所需的營養(yǎng)物質(zhì),從此一系列研究揭示了腫瘤與血管的關(guān)系,想通過抑制腫瘤血管生成來治療腫瘤。淋巴管轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要方式之一,許多腫瘤自身可以分泌一些分子例如VEGF-C或者VEGF-D等,促進腫瘤中淋巴管再生。神經(jīng)常與血管、淋巴管在體內(nèi)相伴行,類似于血管生成和淋巴管新生一些研究顯示腫瘤

2、中可能也有神經(jīng)新生;精神心理因素與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),患抑郁癥、應(yīng)激等癥的患者腫瘤患病率比普通人群高。研究證實,多種惡性腫瘤組織中有神經(jīng)纖維的分布,但是腫瘤與神經(jīng)纖維之間相互作用關(guān)系目前尚不清楚。
　　【目的】
　　1.建立腫瘤與神經(jīng)三維共培養(yǎng)模型,為后續(xù)實驗提供平臺。
　　2.體外研究腫瘤與神經(jīng)相互作用的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),為揭示腫瘤與神經(jīng)的相互影響提供依據(jù)。
　　3.比較食管癌神經(jīng)周浸潤的兩種檢測方法,為臨床統(tǒng)一

3、診斷方法提供支持;分析食管鱗癌的神經(jīng)周浸潤與患者臨床病理關(guān)系。
　　【方法】
　　1.采用原代分離培養(yǎng)的方法,提取大鼠的背根神經(jīng)節(jié);用慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白于食管癌細胞系EC109,Matrigel包被背根節(jié)和食管癌EC109細胞進行三維共培養(yǎng)。
　　2.利用腫瘤細胞與神經(jīng)混合培養(yǎng)法和三維共培養(yǎng)法,觀察食管癌細胞與神經(jīng)生長之間的相互作用,計算神經(jīng)軸突生長的數(shù)目與面積,觀察神經(jīng)節(jié)對腫瘤細胞的形態(tài)學(xué)影響以及腫瘤細胞沿神經(jīng)遷

4、移的神經(jīng)周浸潤現(xiàn)象。采用實時定量PCR檢測食管癌細胞系EC109和EC9706中神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)的表達。
　　3.分別運用HE染色和神經(jīng)元特異性抗體S100免疫組織化學(xué)法,共同評價126例食管鱗癌標本中神經(jīng)周浸潤的水平,分析兩種方法的優(yōu)缺點;分析神經(jīng)周食管癌細胞浸潤與患者的臨床病理關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1.成功地建立了食管癌細胞系與大鼠的背根神經(jīng)節(jié)體外三維共培養(yǎng)模型,為進一步實

5、驗提供了良好的研究平臺。
　　2.食管癌細胞與背根節(jié)細胞混合普通培養(yǎng),背根節(jié)發(fā)出的軸突靶向腫瘤細胞生長。食管癌細胞與背根節(jié)組織三維共培養(yǎng),面向腫瘤細胞側(cè)背根節(jié)組織長出的軸突較長、較濃密,背對腫瘤細胞側(cè)的軸突則較短、較稀疏;共培養(yǎng)第4天,面向腫瘤側(cè)與背對側(cè)神經(jīng)纖維的數(shù)目分別為28和7個,面向腫瘤側(cè)與背對側(cè)神經(jīng)纖維面積分別為109μm2和42μm2;共培養(yǎng)第7天,面向腫瘤側(cè)神經(jīng)軸突的數(shù)目與面積分別為87個和346μm2,背對側(cè)分別為2

6、3個和141μm2,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PCR檢測發(fā)現(xiàn),NGF和BDNF表達于食管癌細胞。另外三維共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),面向神經(jīng)側(cè)的腫瘤細胞形成突起樣結(jié)構(gòu)向神經(jīng)節(jié)方向遷移,而背側(cè)并沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象;第7天時,可見腫瘤細胞增殖明顯,并向著DRG方向凸起性的生長;第9天時,神經(jīng)軸突與腫瘤細胞接觸后,腫瘤細胞沿著軸突進行遷移;第11天時,沿著神經(jīng)纖維遷移的腫瘤細胞數(shù)量明顯增多,腫瘤細胞集落邊緣更加不規(guī)則。
　　3.S100組化染色法

7、與HE染色法相比,S100染色法能夠清晰顯示HE染色法很難確定的神經(jīng)周浸潤。HE染色判斷126例食管癌患者神經(jīng)周浸潤的發(fā)生率為28.57％,而S100染色判斷同一研究對象神經(jīng)周浸潤的發(fā)生率為51.59%。配對樣本卡方檢驗P<0.01、一致性度量Kapaa=0.483,有統(tǒng)計學(xué)意義,兩種檢測方法效果差別顯著。食管癌的神經(jīng)周浸潤與患者的腫瘤大小(P=0.001)、AJCC分期(P<0.001)、T分期(P<0.01)以及腫瘤血管侵犯(P=0

8、.07)有統(tǒng)計學(xué)意義,與年齡、性別、組織分化程度、腫瘤位置、疼痛等未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　【結(jié)論】
　　食管癌與神經(jīng)之間具有相互促進作用。食管癌細胞可以導(dǎo)向神經(jīng)軸突向其生長,并且食管癌對神經(jīng)軸突的生長具有促進作用;神經(jīng)可以對食管癌細胞的增殖等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,并且食管癌細胞可以沿著神經(jīng)纖維逆行向神經(jīng)元方向遷移,即神經(jīng)周浸潤。S100免疫組化染色法比HE染色法對神經(jīng)周浸潤的判斷更加準確,食管癌的神經(jīng)周浸潤可能在食管癌的發(fā)生