Nanog在食管癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)尤以河北、河南、粵東沿海等地區(qū)高發(fā),具有發(fā)病率高、治愈率差和死亡率高等特點(diǎn)。目前食管癌的主要治療方法有手術(shù)、化療和放療等,雖然近年來(lái)隨著診療技術(shù)的提高和治療方法的不斷改進(jìn),食管癌病人的生存率及功能恢復(fù)率大為提高,但是療效仍不盡人意。因此對(duì)食管癌的發(fā)生機(jī)制、診斷和防治研究仍是當(dāng)前腫瘤學(xué)科的熱點(diǎn)課題。
　　 腫瘤是一種基因病,是長(zhǎng)期的、多步驟、多階段、多種基因突變積累的結(jié)果。腫瘤惡性生物學(xué)行

2、為包括細(xì)胞增殖和凋亡失衡、新生血管的形成及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。另外腫瘤細(xì)胞的無(wú)限制增殖能力和演進(jìn)能力與干細(xì)胞的自我更新能力和多能性分化極其類似,這些特點(diǎn)提示腫瘤細(xì)胞中可能會(huì)存在某些類似胚胎干細(xì)胞調(diào)控自我更新的關(guān)鍵基因的異常表達(dá),從而引起單克隆腫瘤細(xì)胞的無(wú)限制增殖。
　　 干細(xì)胞自我更新能力和多能性分化能力的維持是以Nanog、OCT-4和SOX2等轉(zhuǎn)錄因子和PI3K、Wnt和STAT3等信號(hào)通路為主構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控的。N

3、anog是調(diào)控、維持調(diào)控干細(xì)胞自我更新能力網(wǎng)絡(luò)中的主要成員,也是與OCT-4平行的另一條重要的分子調(diào)控途徑。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Nanog基因不僅參與胚胎發(fā)育過(guò)程自我更新能力的調(diào)節(jié),而且在胚胎性癌、精原細(xì)胞瘤等惡性生殖細(xì)胞腫瘤中也異常表達(dá),隨著研究的發(fā)展人們?cè)诜伟?、胃癌等一些?shí)體瘤內(nèi)也檢測(cè)到了Nanog的異常表達(dá)且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而有關(guān)Nanog在食管癌中的表達(dá)及其與食管癌關(guān)系的研究,迄今國(guó)內(nèi)外未鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 為

4、探討Nanog在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況及其與食管癌臨床病理因素之間的關(guān)系,評(píng)價(jià)Nanog和MDR1之間的關(guān)系并分析Nanog的表達(dá)水平對(duì)人食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究檢測(cè)了食管癌組織、癌旁正常組織中Nanog的表達(dá)情況,探討了Nanog與食管癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。并構(gòu)建了攜帶NanogmRNA編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列和siRNA序列的真核表達(dá)載體來(lái)研究Nanog對(duì)食管癌9706細(xì)胞增殖、克隆、侵襲及藥物敏感性等惡性生物學(xué)行為的影

5、響；通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),從多個(gè)方面深入探討Nanog對(duì)食管癌9706細(xì)胞的影響,試圖闡明Nanog的表達(dá)在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。
　　 為使Nanog早日應(yīng)用于食管癌臨床診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究共分以下4章。
　　 第一章、Nanog在食管癌組織中的表達(dá)及意義研究
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)、Real-time PCR和Western的方法檢測(cè)79例食管癌組織和23例癌旁正常組織

6、組織之中Nanog和MDR1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 食管癌組織Nanog和MDR1陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁正常組織,兩種食管組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Nanog陽(yáng)性表達(dá)率與食管癌患者病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；MDR1陽(yáng)性表達(dá)率與食管癌患者病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),且食管癌組織中Nanog和MDR1的表達(dá)相互之間呈明顯的正相關(guān)(P<0.05)。
　　 第二章、Nan

7、og對(duì)食管癌9706細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建攜帶人Nanog mRNA編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列和特異性siRNA序列的真核表達(dá)質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染并篩選出陽(yáng)性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。
　　 2.采用MTT和平板克隆法測(cè)定Nanog對(duì)9706細(xì)胞增殖和克隆能力。
　　 3.采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定Nanog對(duì)9706細(xì)胞周期和凋亡的情況。
　　 4.采用侵襲小室和凝膠沒(méi)譜實(shí)

8、驗(yàn)檢測(cè)Nanog對(duì)9706細(xì)胞侵襲能力和明膠酶活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.pcDNA3.1-Nanog和pSUPER-EGFP-Nanog真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染9706細(xì)胞成功。
　　 2.MTT和平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP組細(xì)胞增殖和克隆能力無(wú)明顯差異(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3組細(xì)胞增殖和克隆能力明顯增強(qiáng)(P<0.01),而pS

9、UPER—EGFP—Nanog—b組細(xì)胞增殖和克隆能力明顯減弱(P<0.01)。
　　 3.FCM結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組各周期細(xì)胞比例無(wú)明顯差異(P>0.05)；pcDNA3.1-Nanog-3組G0／G1期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01),S和G2／M期細(xì)胞比例升高(P<0.05),pSUPER-EGFP-Nanog-b組G0／G1期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01),S和G2／

10、M期細(xì)胞比例減少(P<0.05),同時(shí)與各組相比其凋亡率增加。
　　 4.侵襲小室和凝膠酶譜實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP組侵襲能力和明膠酶活性無(wú)明顯差異(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3組細(xì)胞侵襲能力和明膠酶活性升高,而在pSUPER—EGFP-Nanog-b組降低(P<0.01)。
　　 第三章、Nanog對(duì)食管癌9706細(xì)胞藥物敏感性的影響及機(jī)制研究
　　 方法

11、：
　　 1.采用MTT方法檢測(cè)順鉑對(duì)人食管癌各組9706細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算抑制率。
　　 2.采用FCM檢測(cè)順鉑對(duì)人食管癌各組9706細(xì)胞周期和凋亡率的影響。
　　 3.采用Real-time PCR和Western方法檢測(cè)Nanog對(duì)970細(xì)胞MDR1mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示:Nanog可以對(duì)抗順鉑誘導(dǎo)的9706細(xì)胞的增殖抑制作用,減弱順鉑藥物毒

12、性(P<0.01)。
　　 2.FCM結(jié)果顯示:Nanog可以對(duì)抗順鉑誘導(dǎo)的9706細(xì)胞細(xì)胞G0／G1期周期阻滯和凋亡作用(P<0.01)。
　　 3.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP組細(xì)胞MDR1表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3組升高,而在pSUPER-EGFP-Nanog-b組降低(P<0.01)。

13、
　　 第四章、Nanog對(duì)食管癌9706細(xì)胞裸鼠移植瘤影響的研究
　　 方法：
　　 1.建立人食管癌裸鼠移植瘤模型。分為對(duì)照組、pcDNA3.1-Nanog-3組和pSUPER-EGFP-Nanog-b組。每周測(cè)量瘤體大小并繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。治療終止時(shí)處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計(jì)算抑瘤率。
　　 2.采用TUNEL法檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡情況,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。
　　

14、3.采用Real-time PCR和Western方法檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中Nanog和MDR1表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.pcDNA3.1-Nanog-3組裸鼠移植瘤體積和重量顯著大于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；pSUPER-EGFP-Nanog-b組裸鼠移植瘤體積和重量顯著小于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.TUNEL結(jié)果顯示pSUPER-EG

15、FP—Nanog-b組裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯多于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.pcDNA3.1-Nanog-3組裸鼠移植瘤Nanog和MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01):pSUPER-EGFP-Nanog-b組顯著低于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Nanog在食管癌組織中

16、高表達(dá),與食管癌的病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與MDR1的表達(dá)相互之間呈明顯的正相關(guān)。
　　 2.Nanog促進(jìn)食管癌9706細(xì)胞的增殖、克隆和侵襲及耐藥能力,當(dāng)抑制其表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、克隆和侵襲及耐藥能力的減弱,阻滯細(xì)胞于G0／G1期,誘導(dǎo)凋亡；其機(jī)制與調(diào)控MPP-2和MPP-9分泌及MDR1表達(dá)密切相關(guān)。
　　 3.裸鼠移植瘤模型體內(nèi)試驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,Nanog可以促進(jìn)移植瘤的增殖并調(diào)控MDR1的表達(dá)來(lái)參