食管癌中食管癌相關(guān)基因ECRG-1表達(dá)下調(diào)機(jī)制的研究.pdf

1、食管癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生命。同大多數(shù)惡性腫瘤一樣，食管癌的發(fā)生發(fā)展與多個(gè)癌基因和(或)抑癌基因的異常改變密切相關(guān)。在DNA和染色體水平，抑癌基因異常主要包括點(diǎn)突變、基因缺失、基因易位或重排以及甲基化模式改變，其中等位基因雜合性缺失(1ossofheterozygosity,LOH)和啟動(dòng)子的異常高甲基化是抑癌基因失活的主要機(jī)制，亦是惡性腫瘤普遍存在的分子事件。食管癌相關(guān)基因1(esophagealcanc

2、errelatedgene1，ECRG-1)是應(yīng)用差異顯示技術(shù)克隆出的新的食管癌相關(guān)基因。以往研究表明，ECRG-1在正常食管上皮中表達(dá)，在95％的食管癌組織中低表達(dá)或陰性表達(dá)；同時(shí)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示ECRG-1的過(guò)表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提示ECRG-1基因具有抑癌基因的特性。那么，ECRG-1在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制如何，目前尚不清楚，國(guó)內(nèi)外亦未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為研究食管癌形成過(guò)程中ECRG-1基因失活的主要機(jī)制，本研究采用聚合酶鏈反

3、應(yīng)-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-硝酸銀染色(polymerasechainreaction-Simplesequencelengthpolymorphism，PCR-SSCP)、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶酶切-瓊脂糖電泳(polymerasechainreaction-Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，PCR-RFLP)及亞硫酸氫鹽處理模板-PCR擴(kuò)增-測(cè)序技術(shù)，從雜合性缺失和異常高甲基化方面探

4、討ECRG-1在食管癌中失活的機(jī)制，為闡明食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理和臨床早期診斷及治療提供理論依據(jù)。 目的研究食管癌組織中ECRG-1基因的雜合性缺失發(fā)生率及5’端側(cè)翼序列目的片段CpG島的甲基化狀態(tài)，從分子水平探討食管癌形成過(guò)程中基因失活的主要機(jī)制。 方法1.雜合性缺失分析：選取食管癌組織及鄰近的正常組織80例，提取基因組DNA,以第二外顯子189位的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(singlenucleotidepolymorphism

5、,SNP)和第八外顯子869位限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)為標(biāo)志物，采用PCR-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-硝酸銀染色及測(cè)序技術(shù)分析SNP位點(diǎn)的雜合性缺失發(fā)生率；采用PCR-限制性?xún)?nèi)切酶酶切-瓊脂糖電泳技術(shù)分析酶切位點(diǎn)的雜合性缺失情況。 2.異常甲基化分析：首先培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系EC9706、EC109、NEC，胃癌細(xì)胞系GLC，人胚胎腎永生化細(xì)胞系Hek293，猴腎成纖維細(xì)胞系COS7，鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3等細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，

6、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ECRG-1的mRNA表達(dá)水平；分別提取ECRG-1陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞株DNA及10對(duì)食管癌組織和鄰近正常組織DNA，經(jīng)亞硫酸氫鹽處理DNA模板、PCR擴(kuò)增目的片段后，應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序分析ECRG-1基因5’端側(cè)翼序列CpG島甲基化狀態(tài)；三氧化二砷處理ECRG-1陰性表達(dá)細(xì)胞系，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)三氧化二砷誘導(dǎo)ECRG-1重新表達(dá)的情況。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件

7、包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。率的比較應(yīng)用x2檢驗(yàn)，取a=0.05為顯著性水準(zhǔn)。 結(jié)果1.食管癌組織及鄰近正常組織中ECRG-1基因在不同標(biāo)記位點(diǎn)的LOH結(jié)果在80例食管癌組織中，PCR-SSCP法檢測(cè)到信息個(gè)體25例，等位基因不平衡3例，SNP位點(diǎn)LOH6例(6/25)，非LOH個(gè)體19例；PCR-RFLP法顯示信息個(gè)體28例，等位基因不平衡3例，酶切位點(diǎn)發(fā)生LOH的6例(6/28)，非LOH個(gè)體22例；兩種方法均示信息個(gè)體18例，兩個(gè)位

8、點(diǎn)均發(fā)生LOH4例(22.2％)；至少一種方法顯示為信息個(gè)體35例，至少一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生LOH8例(23％)。在兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)中，SNP位點(diǎn)LOH率較高(24％)，酶切位點(diǎn)LOH率較低(21.5％)，兩者之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 2.細(xì)胞株中ECRG-1的表達(dá)把ECRG-1基因cDNA全長(zhǎng)轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系EC109，以ECRG-1在細(xì)胞EC109中的表達(dá)為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示ECRG-1在食管癌細(xì)胞系EC9706、NEC和EC

9、109、胃癌細(xì)胞系GLC及人胚胎腎永生化細(xì)胞系Hek293中、鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3中均陰性表達(dá)，而在猴腎成纖維細(xì)胞株COS7中有一定程度表達(dá)。 3.5’端側(cè)翼序列CpG島的甲基化狀態(tài)在陰性表達(dá)ECRG-1的食管癌細(xì)胞系EC9706、NEC和EC109中，目的片段CpG位點(diǎn)的核苷酸C仍是C，未發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)換成T，提示均呈高甲基化；而在ECRG-1表達(dá)的COS7細(xì)胞亦未檢測(cè)到一個(gè)非甲基化的位點(diǎn)；測(cè)序結(jié)果顯示，癌組織和鄰近正常組織

10、目的片段序列相同，所測(cè)CpG位點(diǎn)均呈高甲基化狀態(tài)，CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)在兩種組織間無(wú)差異。 4.三氧化二砷誘導(dǎo)去甲基化分別應(yīng)用濃度為1μmol/L和2.5μmol/L的三氧化二砷對(duì)不表達(dá)ECRG-1的細(xì)胞株EC9706、NEC和EC109進(jìn)行去甲基化誘導(dǎo)7d和3d，RT-PCR結(jié)果均未檢測(cè)到ECRG-1的重新表達(dá)。 結(jié)論1.ECRG-1基因在食管癌組織中存在一定程度的雜合性缺失(LOH)，此分子異?？赡茉谑彻馨┑陌l(fā)生發(fā)展

11、中起一定的作用，可能是導(dǎo)致Ecrg-1蛋白表達(dá)水平降低的機(jī)制之一，但由于LOH率小于50％，提示LOH不是ECRG-1失活的主要機(jī)制。 2.限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)和SNP位點(diǎn)可以作為標(biāo)記物用于檢測(cè)ECRG-1基因的LOH。PCR-RFLP技術(shù)和PCR-SSCP-測(cè)序技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，但均為檢測(cè)ECRG-1等位基因LOH的可靠方法。 3.ECRG-1基因5’端側(cè)翼序列目的片段CpG島的高甲基化與食管癌的發(fā)生無(wú)關(guān)，與ECRG-1