食管癌組織中MT和溶菌酶C相互作用的研究.pdf

1、目的:食管癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,對(duì)人類(lèi)的健康已經(jīng)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。我國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū),其發(fā)病率和死亡率均居世界之首。但是食管癌缺乏有效的診斷和治療手段,患者預(yù)后多較差。想要有效的改善食管癌患者的預(yù)后就要解決早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的問(wèn)題。因此早期診斷食管癌,是目前關(guān)于食管癌研究的熱門(mén)問(wèn)題,只要解決食管癌早期診斷問(wèn)題,提高食管癌的治療效果、提高術(shù)后病人的5年生存率等問(wèn)題將迎刃而解。蛋白質(zhì)組學(xué)作為腫瘤研究的新平臺(tái),通過(guò)從整體水平研究食管

2、癌蛋白質(zhì)間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,對(duì)食管癌早期診斷,尋找新標(biāo)志物,治療以及開(kāi)發(fā)藥物治療新靶點(diǎn)等方面具有重要意義。
　　 金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)是在1957年由馬腎中首次分離得到的。是一種分子量低(6-7kDa)、富含半胱氨酸(30％)、缺乏芳香族氨基酸的蛋白質(zhì),具有維持金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、重金屬解毒和清除自由基等方面的作用。是目前為人們所知的最有效的自由基清除劑,可以起到抑制癌癥發(fā)生、消除炎癥、防治腎病和治療胃潰瘍等

3、作用。其特殊的結(jié)構(gòu)和理化特性以及獨(dú)特的生物學(xué)功能對(duì)于疾病的發(fā)生、發(fā)展的研究和探討中起到了重要作用。目前關(guān)于MT在食管癌組織與癌旁正常組織之間蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道較多,而針對(duì)MT相關(guān)蛋白質(zhì)的研究較少,尋找及篩選食管癌組織和癌旁正常組織之間MT相關(guān)的特異性差異蛋白質(zhì)對(duì)解決食管癌早期診斷問(wèn)題具有重要意義。本研究擬應(yīng)用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)和SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-Polyacrylam

4、idegelelectrophoresis,SDS-PAGE)技術(shù)結(jié)合液相質(zhì)譜聯(lián)用(Liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS)技術(shù),對(duì)食管癌組織與癌旁正常組織之間MT相關(guān)的特異性差異蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選及鑒定,以找到同食管癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的蛋白,從而通過(guò)對(duì)這些相關(guān)蛋白的進(jìn)一步深入的研究來(lái)推動(dòng)食管癌早期診斷、治療等問(wèn)題的解決。
　　 方法:
　　 1.選取2011年9月至201

5、2年2月在河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的食管癌患者16例,其中男10例,女6例,年齡42-76歲,平均年齡(57.8±12.7)歲,其中食管上段癌2例,中段癌8例,下段癌6例。國(guó)際食管癌TNM分期:Ⅰ期2例,ⅡA期5例,ⅡB期4例,Ⅲ期4例,Ⅳ期1例。組織分級(jí):高分化癌5例,中分化癌8例,低分化癌3例。術(shù)中取腫瘤中心(去除壞死組織)及選取距癌緣5cm以上的食管“正常”粘膜組織作為正常對(duì)照,用液氮罐轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存。待術(shù)后

6、病理證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌并確認(rèn)食管殘端為正常食管粘膜上皮后入組研究。
　　 2.提取食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的可溶蛋白質(zhì),以Bradford方法檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的濃度。應(yīng)用Co-IP技術(shù)提取MT及其相關(guān)蛋白,應(yīng)用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)將樣品中的蛋白進(jìn)行分離,比較食管癌組織和癌旁正常組織的凝膠電泳圖譜,取MT條帶明顯處切取條帶。
　　 3.將差異明顯的蛋白條帶篩選出來(lái),在膠內(nèi)進(jìn)行溶解并將這些蛋白質(zhì)提取出來(lái),將提

7、取的蛋白用LC-MS技術(shù)分析鑒定,并通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析所鑒定出差異蛋白的功能。
　　 4.應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡的方法(Westernblot)驗(yàn)證其中一種差異蛋白水平的表達(dá),與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。
　　
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:利用FujifilmLas-4000軟件統(tǒng)計(jì)分析目標(biāo)條帶的積分光密度,以β-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件行單因素方差分析,各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±

8、SD)記錄,并用EXCEL作圖。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用Co-IP聯(lián)合SDS-PAGE技術(shù),獲得了食管癌組織及癌旁正常組織MT相關(guān)蛋白的蛋白圖譜。分析得到的蛋白圖譜并從中選取64條差異明顯的蛋白條帶,切取這些蛋白質(zhì)條帶,將蛋白質(zhì)條帶在膠內(nèi)進(jìn)行溶解,用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用LC-MS技術(shù)對(duì)所得的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分析,鑒定出31種蛋白質(zhì),將結(jié)構(gòu)蛋白及高豐度蛋白從中篩除,通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)軟件對(duì)其余蛋白進(jìn)行分析,確定出3種可能與

9、食管癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的蛋白質(zhì),分別為溶菌酶C(lysozymeC)、鋅α2糖蛋白(alpha-2-glycoprotein1,zinc)、載脂蛋白-1亞型1(lipocalin-1isoform1)。
　　 2.應(yīng)用Westernblot技術(shù)對(duì)lysozymeC在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示:與癌旁正常組織相比,lysozymeC于MT的蛋白復(fù)合物的表達(dá)上調(diào)(t=-32.183,p=0.000),與蛋白質(zhì)組學(xué)得到的結(jié)果一致

10、。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種食管癌組織及癌旁正常組織之間的MT相關(guān)的差異蛋白,并證實(shí)食管癌組織及癌旁正常組織中MT相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異。這3種差異表達(dá)的相關(guān)蛋白可能參與了食管癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程。
　　 2.對(duì)其中一種差異蛋白lysozymeC應(yīng)用Westernblot的方法在蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證,其結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)果一致,證明本研究結(jié)果具有較高可信度。
　　 3.lys