酵母雙雜交篩選肺癌組織中MT1H相互作用蛋白.pdf

1、目的：
　　 金屬硫蛋白家族(metallothieonein,MT)富含巰基的低分子量(6kD)蛋白質(zhì),MT由61～62個(gè)氨基酸組成。MT家族可分為MT1、MT2、MT3和MT4四種異構(gòu)體。MT1(包括MT1A、MT1B、MT1E、MT1G、MT1F、MT1X、MT1H 7個(gè)亞型)。MT有調(diào)節(jié)重金屬(鋅等)與蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)、清除自由基,解毒等作用。
　　 以往對(duì)MT1H的研究主要集中在其與一些重金屬(

2、如鋅、鎘、銅、銀等)代謝方面的研究,但有關(guān)MT1H相互作用蛋白所知甚少,未見相關(guān)報(bào)道。有關(guān)MT與腫瘤間關(guān)系報(bào)道不一,提示其在不同腫瘤中作用也各不相同。MT1G在甲狀腺乳頭狀腫瘤中表達(dá)下調(diào),可能是甲狀腺瘤的抑癌基因；在浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管癌中MTⅠ和Ⅱ過表達(dá)；在消化道癌、睪丸生殖腺腫瘤、涎腺腫瘤、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌組織中觀察到MT過表達(dá),以上對(duì)MT在腫瘤學(xué)中的研究并沒有對(duì)MT的各個(gè)亞型進(jìn)行劃分,可能MT各個(gè)的亞型在不同的腫瘤中發(fā)揮

3、不同的作用。
　　 有一些報(bào)道認(rèn)為致癌過程中MT的產(chǎn)生與致癌物質(zhì)的刺激,癌基因激活有關(guān)。如:化學(xué)致癌物質(zhì)乙基甲硝脲可激活體外培養(yǎng)的S49細(xì)胞MT的產(chǎn)生,那么腫瘤中尤其是肺癌中有哪樣一些蛋白與其作用呢?我們利用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選出與MT1H作用的相關(guān)蛋白,并為進(jìn)一步依據(jù)其相互作用蛋白研究其功能提供依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1、文庫(kù)、菌株、質(zhì)粒和試劑
　　 第三代Matchmaker Ga14雙雜交

4、系統(tǒng)(MATCHMAKER GAI4 yeast two hybridsystem3.Clontech):BD克隆質(zhì)粒pGBKT7,AD克隆質(zhì)粒pGADT7,BD質(zhì)粒陽性對(duì)照pGBKT7-T,BD質(zhì)粒陰性對(duì)照pGBKT7-Lam。酵母菌株AH109、酵母培養(yǎng)基YPDA、人工合成營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(synthetic dropout minimal base,SD)SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-

5、Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、X-a-半乳糖苷酶(X-a-gal)均購(gòu)自Clontech公司。肺癌cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司。大腸桿菌Topo10C為本教研室保存。所需的限制性內(nèi)切酶,LATaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司。酸洗玻璃珠購(gòu)自Sigma公司。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)誘餌BD質(zhì)粒pGBKT7-MT1H的構(gòu)建及鑒定
　　 獲得

6、的人全長(zhǎng)MT1H基因利用經(jīng)PCR引入的NdeI/BamHI雙酶切位點(diǎn)定向亞克隆至pGBKT7,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Topo10,卡那霉素篩選相應(yīng)陽性克隆,雙酶切提取的質(zhì)粒鑒定插入片斷大小,為BD質(zhì)粒pGBKT7.MTlH,測(cè)序結(jié)果與GeneBankMT1H序列比較同源性。
　　 (2)酵母雙雜交篩選
　　 ①采用醋酸鋰法將酵母雙雜交系統(tǒng)中的重組誘餌載體pGBKT7-MT1H與肺癌cDNA文庫(kù)質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109

7、,涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal平板上,30℃培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出,篩選藍(lán)色的陽性克隆。挑取所有單菌落的陽性克隆,在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal平板上反復(fù)傳代3次,每次均以X-a-gal篩選,排除假陽性。
　　 ②提取的大腸桿菌質(zhì)粒DNA以pACT 5’、3’AD擴(kuò)增引物PCR,產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ酶切,瓊脂糖凝膠電泳,去除重復(fù)的陽性克隆。對(duì)陽性質(zhì)粒DNA測(cè)序分析鑒定。經(jīng)G

8、eneBank生物信息學(xué)分析確定基因。
　　 ③回復(fù)雜交驗(yàn)證:將陽性克隆接種于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液體培養(yǎng)基培養(yǎng),玻璃珠法提取酵母。陽性克隆的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Topo10C,卡那霉素篩選克隆,提取質(zhì)粒DNA,與重組質(zhì)粒pBGKT7-MT1H共同轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal,不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落為白斑者作為假陽性排除。
　　 結(jié)

9、 果
　　 1、誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MT1H的構(gòu)建及鑒定
　　 pGBKT7-MT1H經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切后,產(chǎn)生242bp左右大小DNA片段,與理論擴(kuò)增大小一致。測(cè)序結(jié)果表明融合區(qū)域的讀碼框正確并有正確的方向。經(jīng)測(cè)序證實(shí)為人MT1H序列且無堿基突變。
　　 2、誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MT1H的毒性及自激活效應(yīng)檢測(cè)
　　 將直徑相同的AH109(pGBKT7-MT1H)和AH109(pGBKT

10、7)分別在3ml的YPDA液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后,600nm的吸光度分別為1.20和1.22,表明構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母沒有毒性,不能影響酵母正常生長(zhǎng)。AH109(pGBKT7-MT1H)在SD/-Trp/X-α-gal生長(zhǎng)出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-gal不生長(zhǎng),排除了pGBKT7-MT1H激活自身報(bào)告基因的能力。
　　 3、基因序列的測(cè)定與分析
　　 (1)陽性克隆的分類
　　 在SD/-Le