酵母雙雜交篩選PA28γ相互作用蛋白.pdf

1、研究背景及目的:PA28γ（又稱REGγ、11Sγ、PSME3）是一種蛋白酶體調(diào)節(jié)因子，它能結(jié)合到20S蛋白酶體的外環(huán)并促進(jìn)小肽的降解，這個(gè)過(guò)程并不依賴蛋白的泛素化也不依賴ATP，這與PA700不同，后者是一種能識(shí)別并降解泛素化蛋白的大分子復(fù)合物。目前已經(jīng)有證據(jù)證明，PA28γ-20S蛋白酶體也能降解完整的蛋白分子，如HCV-core和SRC-3。這說(shuō)明PA28γ-20S蛋白酶體能參與重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　 PA28γ是PA

2、28（包括PA28α、PA28β、PA28γ）三種同系物中最保守的一種，而且它主要定位在細(xì)胞核中，這與其他兩種同系物主要定位在細(xì)胞質(zhì)中不同，這可以認(rèn)為PA28γ與其他兩種同系物相比存在著不同的生理功能。
　　 目前對(duì)泛素—蛋白酶體通路的研究已較為深入并取得一些實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，包括蛋白酶體抑制劑的藥用研發(fā)和應(yīng)用(如Velcade，雷公藤紅素(Celastrol)等），但對(duì)泛素非依賴性—蛋白酶體途徑的認(rèn)識(shí)還有待深入。值得關(guān)注的是最新研究

3、發(fā)現(xiàn)，PA28γ也能夠降解完整的內(nèi)源性蛋白分子，是新發(fā)現(xiàn)的蛋白酶體降解蛋白的泛素—非依賴機(jī)制途徑上的一個(gè)重要蛋白酶體因子。細(xì)胞誘導(dǎo)分裂實(shí)驗(yàn)、PA28γ基因敲除小鼠研究、以及RNAi干擾研究等均證實(shí):PA28γ參與了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞周期的調(diào)控，PA28γ在有絲分裂細(xì)胞及快速增長(zhǎng)細(xì)胞中高表達(dá)（包括在快速分裂的甲狀腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)），而knockdown或knockout PA28γ可降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、阻止細(xì)胞周期進(jìn)入S期。一些實(shí)驗(yàn)室在對(duì)

4、腫瘤凋亡蛋白相互作用蛋白篩選時(shí)意外發(fā)現(xiàn)B-Raf、MEKK3、FLASH(CASP8-assosiated protein2)、Daxx、RanBPM、PIASI等細(xì)胞凋亡相關(guān)因子均能與PA28γ相互作用。而Li研究組在研究乳腺癌細(xì)胞時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并證明PA28γ能與癌基因SRC-3相互作用并在體內(nèi)、體外降解這種完整的內(nèi)源性蛋白(Cell，2006)。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)重要的PA28γ作用靶蛋白，如細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21、P16、P19

5、(Li et al。Mol Cell,2007; Chen et al。Mol Cell,2007),P53(Zhang, EMBO,2008),G結(jié)合蛋白受體(NakahataN，2007)及泛素連接酶smurf1(FEBS Lett，2010)等。有研究表明PA28γ可作為乳腺癌的潛在標(biāo)志蛋白，它能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(Med Oncol，2011)。但研究發(fā)現(xiàn)小鼠和人不同組織的PA28γ的mRNA和蛋白水平不一致。最近的研究發(fā)現(xiàn)P

6、A28γ參與了DNA損傷修復(fù)反應(yīng)(cell cycle，2011)。這些最新的研究分析表明，PA28γ與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尤其在凋亡機(jī)制和通路上，具有十分重要的生物學(xué)功能，甚至有望成為腫瘤治療的輔助藥靶（增敏劑）(I Mao，Cell Mol Life Sci，2008;2005)。鑒于PA28γ是一種核定位蛋白（這不同于其同系物PA28α、PA28β定位在胞漿），但在細(xì)胞有絲分裂期卻彌漫整個(gè)細(xì)胞，推測(cè):PA28γ的不同細(xì)胞定位對(duì)細(xì)胞不同

7、時(shí)期有著不同的影響，與PA28γ對(duì)上述重要靶蛋白的精細(xì)調(diào)控密切相關(guān)。前期研究初步驗(yàn)證了這一點(diǎn):構(gòu)建的胞漿定位表達(dá)截?cái)囿wPA28γ KL03-15和PA28γ KL03-17與核定位表達(dá)截?cái)囿wPA28γ KL03-3對(duì)HepG2和Chang細(xì)胞的生長(zhǎng)起到了不同的作用（王穗海，碩士畢業(yè)論文，2008）。最新研究證實(shí)，PA28γ的過(guò)表達(dá)與直腸結(jié)腸癌、甲狀腺癌和肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對(duì)92例原發(fā)性肺癌，48例結(jié)腸癌，49例甲狀腺癌和206例肝

8、癌樣本進(jìn)行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PA28γ的例數(shù)均超過(guò)50％。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和芯片驗(yàn)證平臺(tái)選出與其相關(guān)基因，并驗(yàn)證了它可通過(guò)作用于p53、mcy通路等促進(jìn)這些腫瘤的病理過(guò)程。
　　 肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬(wàn)，居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按細(xì)胞分型可分為肝細(xì)胞型肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌及混合型肝癌。按腫瘤

9、的形態(tài)可分為結(jié)節(jié)型、巨塊型和彌漫型。原發(fā)性肝癌在我國(guó)屬于高發(fā)病，一般男性多于女性。中國(guó)是乙肝大國(guó)，我國(guó)的肝癌多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，丙肝病人也在逐漸增加，乙肝后也會(huì)發(fā)展為肝癌。目前我國(guó)發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55％，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的一大殺手，其危險(xiǎn)性不容小視。
　　 雖然目前已有研究表明PA28γ與細(xì)胞增殖、凋亡等重要的生物學(xué)功能密切相關(guān)，但它在肝癌細(xì)胞周期中作用機(jī)制及方式還需要深

10、入研究。本項(xiàng)目通過(guò)酵母雙雜交篩選與PA28γ相互作用的肝細(xì)胞蛋白，以研究其對(duì)肝癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響的研究，探討PA28γ在肝癌的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。
　　 方法:通過(guò)酵母雙雜交篩選與PA28γ相互作用的肝細(xì)胞蛋白，并將陽(yáng)性基因構(gòu)建克隆表達(dá)載體以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。
　　 1、設(shè)計(jì)可連接于PGBKT7載體的PCR引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增到得的PA28γ基因;
　　 2、連接于誘餌載體pGBKT7，獲得誘餌質(zhì)

11、粒pGBKT7-PA28γ蛋白酶體激活因子酵母雙雜交誘餌載體;
　　 3、將pGBKT7-PA28γ轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2HGOLD;
　　 4、與SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測(cè)PA28γ蛋白酶體激活因子在Y2HGOLD酵母菌株中的對(duì)報(bào)告基因有無(wú)激活作用及細(xì)胞毒性;
　　 5、western Blot鑒定PA28γ在Y2HGOLD酵母菌株中表達(dá);
　　 6、將表達(dá)

12、PA28γ良好的酵母珠Y2HGOLD與含人肝細(xì)胞全cDNA的酵母珠Y187融合雜交，與DD0/X/A培養(yǎng)基中培養(yǎng);
　　 7、篩選出藍(lán)斑，培養(yǎng)于通過(guò)DD0/X/A培養(yǎng)基;復(fù)篩一次;
　　 8、T7引物擴(kuò)增測(cè)序鑒定;
　　 9、構(gòu)建陽(yáng)性克隆表達(dá)載體;
　　 10、轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞并通過(guò)western blot檢測(cè)其表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建通過(guò)pGBKT7-PA28γ蛋白酶體激活因子酵母雙雜交誘

13、餌載體，western blot鑒定PA28γ在缺陷型酵母菌株Y2HGOLD中表達(dá)，pGBKT7-PA28γ蛋白酶體激活因子酵母雙雜交誘餌載體在Y2HGOLD中無(wú)自激活作用，酵母雙雜交篩選到的陽(yáng)性克隆有TXNIP，ZPR9，MAX，rarres2，GNPTG等。成功構(gòu)建TXNIP和ZPR9表達(dá)載體，westem blot結(jié)果顯示傳染了目的質(zhì)粒的AGS細(xì)胞中有目的蛋白的表達(dá)。
　　 進(jìn)一步文獻(xiàn)分析表明，TXNIP，ZPR9，MAX

14、，rarres2，GNPTG這些基因與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。如硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP)在細(xì)胞增殖、凋亡、分化的過(guò)程以及腫瘤、應(yīng)激性疾病的發(fā)生中具有重要功能。作為一個(gè)氧還反應(yīng)的調(diào)節(jié)子，TXNIP能與硫氧還蛋白(Trx)相結(jié)合，下調(diào)Trx的表達(dá)，而Trx則在DNA的損傷及細(xì)胞凋亡機(jī)制中有著關(guān)鍵的作用。TXNIP基因是一個(gè)新的抑癌基因，它在人類乳腺癌、肝癌、肺癌等癌組織細(xì)胞中均表達(dá)下降，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。TXNIP的缺失可以

15、促使腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。而在抗腫瘤機(jī)制中，TXNIP可通過(guò)參與細(xì)胞周期阻滯、低氧調(diào)節(jié)、影響NK細(xì)胞(NK cell)發(fā)育等過(guò)程介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 有報(bào)道稱c-Myc基因重要伙伴蛋白Max基因缺失條件下胚胎干細(xì)胞喪失多能性并發(fā)生細(xì)胞死亡的機(jī)制研究進(jìn)展。c-Myc基因參與多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞周期調(diào)控，致瘤性轉(zhuǎn)化和體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。 c-Myc基因也是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)自我更新和胚胎干細(xì)胞(ESCs)

16、全能性的調(diào)節(jié)因子。超過(guò)70％的惡性腫瘤細(xì)胞存在Myc基因的過(guò)度表達(dá)。Myc是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的許多方面，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡等，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路異常，引起細(xì)胞異常增殖。
　　 ZPR9屬于鋅指基因家族，此類基因是人體中最大的基因家族，它參與細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，并與許多疾病的發(fā)生相關(guān)。ZPR9可以作為蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的小鼠38生理基板(MPK38)的底物，參與各種細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞周期，細(xì)胞

17、凋亡，胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生。
　　 GNPTG基因編碼產(chǎn)物為N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的γ亞基。有研究證實(shí)葡萄糖胺可以通過(guò)抑制蛋白酶體的活性誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，這過(guò)程與N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶及PA28γ的活性相關(guān)。
　　 結(jié)論:通過(guò)酵母雙雜交，我們篩選得到TXNIP，ZPR9，MAX，rarres2，GNPTG等，這些蛋白與細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重大關(guān)系。為我們進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們相互作用的情況以