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文檔簡介
1、目的:本課題研究的目的是在正常人腦cDNA文庫中通過酵母雙雜交技術篩選與人DND1相互作用的蛋白質,并對篩選出的蛋白質進行相關功能初步分析,為進一步研究人DND1的功能及信號通路奠定基礎。
方法:(1)以人dnd1cDNA為模板用PCR的方法擴增人dnd1目的基因,目的片段和重組質粒行雙酶切,連接,轉化大腸桿菌,構建人DND1蛋白的酵母雙雜交誘餌質粒pDBleu-dnd1,測序比對結果匹配后檢驗其毒性和自激活性,同時擴增正常人
2、腦cDNA文庫,為下一步進行DND1蛋白的相互作用蛋白篩選及相互作用網絡的構建奠定基礎;
(2)在正常人腦cDNA文庫中,利用酵母雙雜交技術篩選與人DND1相互作用的蛋白,得到的陽性克隆質粒行雙酶切及測序鑒定;(3)用共轉化法將誘餌質粒pDBleu-dnd1和陽性克隆質粒回轉入酵母菌AH109中進一步驗證;(4)回轉驗證陽性克隆質粒提取后行測序及同源性分析。
結果:(1)構建了穿梭質粒pDBleu-dnd1,并通過檢
3、測證實構建的重組質粒對酵母菌無毒性,無自激活性;(2)應用酵母雙雜交技術以及生物信息學分析,我們在正常人腦組織的cDNA文庫中篩選出四個與人DND1有相互作用的蛋白質,分別為GRN,FLAD1,EFEMP1,RNF31。通過酵母雙雜交回轉驗證及NCBI數據庫中blast分析,排除酵母蛋白干擾、實驗結果假陰性、假陽性,比對DNA序列100%匹配。
結論:(1)成功構建用于酵母雙雜交技術篩選的誘餌質粒pDBLeu-Dnd1;(2)
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