應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與PITX2相互作用的蛋白.pdf

1、心房顫動(dòng)(房顫,atrial fibrillation),是臨床上最常見并且危害嚴(yán)重的心律失常,其62％高遺傳率提示遺傳因子在房顫發(fā)生中起關(guān)鍵作用,但大部分房顫致病或易感基因還未發(fā)現(xiàn)。2007年,應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)在冰島人群中首次發(fā)現(xiàn)位于4q25區(qū)域的SNPrs2200733與房顫高度關(guān)聯(lián),隨后在不同的群體研究中得到了驗(yàn)證。與SNPrs2200733距離最近的已知基因是PITX2,該基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)

2、PITX2在房顫發(fā)生中起關(guān)鍵作用,敲低PITX2在小鼠心臟中的表達(dá)容易誘發(fā)房顫表型,但其致病機(jī)理尚不完全清楚。因此,為深入解析房顫的分子遺傳學(xué)機(jī)制,本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選在心臟中與PITX2相互作用的蛋白,為研究PITX2的致病機(jī)理提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)首先以從ORIGENE公司購(gòu)買的PITX2cDNA為模板,PCR擴(kuò)增975bpPITX2c全長(zhǎng)序列,構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-PITX2。將誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH

3、109,未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞毒性以及自激活現(xiàn)象。隨后將已轉(zhuǎn)化誘餌載體的酵母細(xì)胞Y187與人心臟cDNA文庫(kù)進(jìn)行Yeasting mating,通過營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選,后經(jīng)多次營(yíng)養(yǎng)篩選、X-β-gal顯色反應(yīng)分析等來排除假陽(yáng)性克隆,最后共得到286個(gè)陽(yáng)性克隆。我們對(duì)其中100個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具進(jìn)行同源比對(duì),最后發(fā)現(xiàn)WDR6(Homo sapiens WD repeat-contain