酵母雙雜交法篩選咽癌細(xì)胞中FLOT2相互作用蛋白.pdf

1、鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma）是一種起源于鼻咽部的惡性腫瘤，在我國南方省份、東南亞國家和非洲部分地區(qū)高發(fā)。其發(fā)病可能是膳食結(jié)構(gòu)、病毒感染、遺傳突變和環(huán)境因素等多個因素共同作用導(dǎo)致的。臨床上鼻咽癌具有早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點。研究表明大部分患者以頸部淋巴結(jié)腫大為最初表現(xiàn)，相當(dāng)部分患者會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者治療失敗和復(fù)發(fā)的幾率則大大增加。
　　浮艦蛋白Flotillins家族

2、最早是在金魚視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損后軸突的再生過程中被發(fā)現(xiàn)的一類蛋白，是一種脂筏標(biāo)志性蛋白，主要定位于細(xì)胞膜內(nèi)表面，在多種類型細(xì)胞中廣泛存在。在細(xì)胞膜上，其作為腳架，為蛋白間相互作用提供平臺，也參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)再生、內(nèi)吞作用、淋巴細(xì)胞活化等。
　　前期工作中，我們利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractive hybridization，SSH)，以來源于同一鼻咽癌細(xì)胞系SUNE-1的具有不同轉(zhuǎn)移能力的兩個亞

3、株5-8F(高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力)和6-10B（成瘤、無轉(zhuǎn)移能力）為材料，構(gòu)建了兩個亞細(xì)胞株間的消減cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的數(shù)個差異表達(dá)的基因，然后選擇Flotillin-2(Flot2)作為后續(xù)的研究對象。采用RNAi技術(shù)干擾Flot2后5-8F細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力均下降，G1期細(xì)胞比例上升，提示Flot2可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
　　本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建5-8F細(xì)胞系的cDNA文庫，采用酵母雙雜交技

4、術(shù)篩選出Flot2相互作用蛋白并進(jìn)行鑒定。實驗結(jié)果如下:
　　首先，我們以NCBI上的Flot2基因CDS序列為模板從5-8F細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出了其ORF序列，然后我們將其體外連接到pGBKT7-BD載體上，構(gòu)建了該基因的酵母誘餌表達(dá)載體(pGBKT7-Flot2)。同時，利用LD-PCR方法構(gòu)建了5-8F細(xì)胞的cDNA文庫并同源重組進(jìn)pGADT7-AD載體中，構(gòu)建了pGADT7-cDNA的文庫質(zhì)粒。將上述載體分別轉(zhuǎn)化Y2HGo

5、ld和Y187酵母菌，采用酵母雙雜交的方法篩選出陽性克隆，然后抽提質(zhì)粒測序分析，將可能的相互作用蛋白的質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化Y2HGold菌鑒定。
　　實驗結(jié)果顯示以Flot2為誘餌蛋白篩選5-8F細(xì)胞文庫后獲得陽性克隆36個，經(jīng)過測序與序列比對，發(fā)現(xiàn)有5個蛋白(PLCD3、PCDH7、PTPRJ、PCBP1和copineⅡ)有可能與Flot2有相互作用，然后通過共轉(zhuǎn)化的方法鑒定了是否發(fā)生相互作用，回交結(jié)果顯示其中4個蛋白(PL