酵母雙雜交篩選與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì).pdf

1、目的:前期工作中以改良的錨定消減雜交技術(shù)構(gòu)建了大鼠脊髓全橫斷模型的差異表達(dá)cDNA文庫，經(jīng)點(diǎn)雜交排除假陽性和半定量PCR驗(yàn)證，從中篩選到一批差異表達(dá)EST序列。其中的新基因Scirr1編碼蛋白具有“F-box+LRR”結(jié)構(gòu)域，稱為Fbxl16（又稱SCIRR1）。Fbxl16是急性脊髓損傷后高調(diào)表達(dá)的新蛋白之一，本文目的在于尋找體內(nèi)能夠與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì),用以揭示該蛋白的功能及其在脊髓損傷修復(fù)過程中的作用，以期通過該蛋白的研

2、究尋找促進(jìn)損傷脊髓修復(fù)的藥物靶標(biāo)。
　　方法:制作大鼠脊髓全橫斷損傷模型，提取損傷段脊髓總RNA；通過RT-PCR技術(shù)克隆新Scirr1的編碼區(qū)序列；測序正確后，將該基因的EST序列構(gòu)建入載體pSos的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建質(zhì)粒pSos-scirr1；酵母雙雜交預(yù)實(shí)驗(yàn)明確系統(tǒng)效率、排除pSos空載體對RAS系統(tǒng)的自激活活性；把該重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白hSos-Fbxl16作為誘餌蛋白,以改良的酵母雙雜交技術(shù)篩選大鼠腦cDNA文庫，篩選出能

3、夠與Fbxl16假定陽性相互作用的蛋白質(zhì)；最后用酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對獲得的假定相互作用的可靠性加以驗(yàn)證。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pSos-scirr1之后,篩選出了11個(gè)與Fbxl16假定陽性相互作用的蛋白質(zhì)；通過回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,確定其中兩個(gè)蛋白能與Fbxl16相互作用,兩者分別是cAMP依賴蛋白激酶α型催化亞基（proteinkinase,cAMP-dependent,catalytic,alpha；Prkaca)和

4、衣被蛋白復(fù)合物ζ亞基（coatomer protein complex,subunit zeta1；Copz1).
　　結(jié)論:Prkaca作為cAMP依賴蛋白激酶α型催化亞基,是體內(nèi)該酶催化亞基的主要存在形式。Prkaca與Fbxl16相互作用的發(fā)現(xiàn)是關(guān)注的要點(diǎn)，它和脊髓損傷有關(guān)，其傳導(dǎo)通路cAMP依賴蛋白激酶傳導(dǎo)通路（PKA）在脊髓損傷修復(fù)中表現(xiàn)出重要意義。
　　脊髓損傷后中樞受損時(shí)，相應(yīng)外周感覺神經(jīng)元損傷后不能再生。在腰

5、髓背根神經(jīng)節(jié)微量注射膜通透cAMP類似物能夠促進(jìn)受損的中樞神經(jīng)再生；刺激cAMP信號通路能夠提升受損的感覺神經(jīng)元的內(nèi)在的生長能力。
　　神經(jīng)營養(yǎng)因子能增加神經(jīng)元的cAMP水平，激活PKA通路，繼而阻斷鞘磷脂相關(guān)糖蛋白對脊髓損傷后神經(jīng)元再生的抑制。
　　在脊髓損傷局部和大腦運(yùn)動(dòng)皮層給入cAMP能誘導(dǎo)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生。
　　細(xì)胞移植和cAMP聯(lián)合治療脊髓損傷再生已經(jīng)受到許多學(xué)者的關(guān)注。cAMP亦能介導(dǎo)調(diào)控BDNF水平

6、。
　　所以，脊髓損傷修復(fù)相關(guān)蛋白Fbxl16和蛋白激酶A催化亞基PKAC-alpha相互作用的發(fā)現(xiàn)無疑為解釋cAMP通路與脊髓損傷的關(guān)系，進(jìn)而為闡明脊髓損傷的分子機(jī)理帶來新的思路，也為脊髓損傷治療的藥物干預(yù)提供新的方向。
　　細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)各個(gè)部分之間的物質(zhì)傳遞常常通過膜泡運(yùn)輸方式進(jìn)行。衣被蛋白（coatomer protein complex）是一種構(gòu)成運(yùn)輸膜泡表面衣被的蛋白復(fù)合體。它們具有兩個(gè)主要作用：①選擇性的將特定蛋

7、白聚集在一起，形成運(yùn)輸小泡；②如同模具一樣決定運(yùn)輸小泡的外部特征，相同性質(zhì)的運(yùn)輸小泡之所以具有相同的形狀和體積，與衣被蛋白的組成有關(guān)。已知三類具有代表性的衣被蛋白，即：籠形蛋白（clathrin）、COPI和COPII，各自介導(dǎo)不同的運(yùn)輸途徑。Copz1是衣被蛋白I（coatomer protein complexI，COPI）的組成蛋白，COPI是一種構(gòu)成運(yùn)輸膜泡表面衣被的蛋白復(fù)合體，負(fù)責(zé)從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜泡運(yùn)輸。Copz1與Fb