羽衣甘藍柱頭酵母雙雜交cDNA文庫的構建及ARC1相互作用蛋白質(zhì)的篩選.pdf

1、植物自交不親和性（Self-incompatibility，SI）是指雌蕊對自己和異己花粉進行識別，通過細胞內(nèi)信號傳遞與級聯(lián)反應，最終抑制自己花粉的生長，阻礙受精作用的過程。SI是植物采取的一種促進異交、避免自交的策略。蕓苔屬植物自交不親和反應發(fā)生的主要部位是在柱頭乳突細胞，通過其細胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應抑制自我花粉的生長。目前，已經(jīng)鑒定出柱頭乳突細胞內(nèi)SI信號傳遞因子ARC1（Arm repeat containing1），ARC1是一個

2、含有U-Box功能域的蛋白，具有E3泛素連接酶活性，通過泛素/26S蛋白酶體途徑將降解其下游底物，從而導致SI的發(fā)生。目前，對于ARC1的下游底物和SI反應機制還尚不清楚。
　　本文以羽衣甘藍（Brassica oleracea var.acephala）S13bS13b自交不親和系為材料，提取柱頭總RNA，通過親和層析法分離純化mRNA，利用CytoTrap XR建庫試劑盒，構建應用于酵母雙雜交系統(tǒng)的羽衣甘藍柱頭cDNA文庫。原

3、始文庫的庫容量為2.5×105，擴增后文庫的庫容量約為4×108，重組率為96％，插入片段大小在0.4-3 kb之間，平均長度在0.8 kb左右。構建了ARC1全長的酵母誘餌表達載體，轉(zhuǎn)化cdc25H酵母細胞對其進行自激活檢測，經(jīng)驗證無自激活現(xiàn)象。以CytoTrap酵母細胞質(zhì)雙雜交系統(tǒng)為操作平臺，利用共轉(zhuǎn)化的方法對羽衣甘藍柱頭酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選，共篩選5×105個酵母克隆，經(jīng)初步驗證和測序得到2個蛋白質(zhì)編碼序列。其中一個蛋白