酵母雙雜交技術篩選hBex1相互作用蛋白.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、伊馬替尼(Imatinib)是臨床治療胃腸間質瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors,GIST)和慢性髓系白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)的一線藥物,然而部分患者在獲得一定時間的緩解期后,由于對Imatinib產生了繼發(fā)性耐藥,導致病情迅速進展。Bex是一類功能尚未闡明的小分子信息轉導中介體,在先前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)hBex1參與了Imatinib的耐藥發(fā)生過程.闡明

2、hBex1介導的信號傳導通路,對于明確Imatinib的耐藥機制,為進一步開發(fā)分子靶向藥物有著重要意義。
　　 目的:建立酵母雙雜交系統(tǒng),從K562細胞cDNA文庫中篩選hBex1相互作用蛋白質,并對候選蛋白進行初步鑒定分析。
　　 方法:1.從pEGFP-C1-hBex1中將hBex1基因開放讀碼框架克隆至pGBKT7載體,構建pGBKT7-hBex1重組質粒,并檢測質粒對酵母的毒性和自激活活性;2.從K562細胞中提

3、取RNA,通過SMART技術和LD-PCR技術擴增K562細胞ds cDNA;3.將pGBKT7-hBex1,pGADT7-Rec、ds cDNA共轉化感受態(tài)酵母,通過SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板篩選陽性克隆;4.將獲得的陽性克隆pGADT7-library質粒與pGBKT7-hBex1質粒共轉化感受態(tài)酵母,通過SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板對相互作用進行驗證;5.對驗證后的陽性克隆質粒進行測序和生

4、物信息學分析。
　　 結果:1.構建了酵母表達質粒pGBKT7-hBex1,檢測證實重組質粒對酵母細胞無毒性作用,無自激活活性;2.共轉化酵母后從SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板篩選出17個陽性克隆,劃線轉種平板重復檢測篩選出13個陽性克隆;3.13個陽性克隆中提取的pGADT7-library重組質粒與pGBKT7-hBex1質粒共轉化感受態(tài)酵母,均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上生長;4

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