與ATP6相互作用的蛋白質(zhì)的篩選及基因的cDNA克隆.pdf

1、植物細胞質(zhì)雄性不育是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的遺傳性狀，在高等植物中，是一種常見的生物學(xué)特征。甘藍型油菜，是世界上廣泛種植的一種油料作物，其雜交種能比親本最高增產(chǎn)60％，因此把雄性不育應(yīng)用于雜交種的生產(chǎn)具有重大的意義。目前，人們對于甘藍型油菜雄性不育的研究主要集中于蘿卜胞質(zhì)不育，波里馬胞質(zhì)不育和nap胞質(zhì)不育。波里馬細胞質(zhì)雄性不育因其不育性穩(wěn)定，容易找到恢復(fù)基因，此不育系被認為在雜交中的生產(chǎn)中是最有優(yōu)勢的。 研究表明，由于線粒體D

2、NA的重排，在編碼ATP合成酶第六亞基的基因(atp6)的上游產(chǎn)生一個嵌合的具有224個密碼子的開放閱讀框(orf 224)，它與atp 6基因共轉(zhuǎn)錄，而這個atp6基因區(qū)域是與甘藍型油菜pol CMS性狀是相關(guān)的。 酵母雙雜交系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種有效的體內(nèi)研究蛋白質(zhì)之相互作用以及篩選cDNA文庫的技術(shù)手段。為了深入研究與ATP6發(fā)生相互作用的，可能與油菜雄性不育有關(guān)的基因，我們采用了酵母雙雜交系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)的篩選。

3、 將atp6基因和載體pGBKT7連接構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7/atp6。將雙鏈cDNA和質(zhì)粒pGADT7-Rec按照順序轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7/atp6的酵母AH109，通過營養(yǎng)缺陷型的選擇和β-半乳糖苷酶(β-lacZ)活性檢測進行篩選，初步獲得酵母陽性克隆。提取陽性酵母的總DNA，進行PCR檢測，并用限制性內(nèi)切酶進行酶切，根據(jù)PCR結(jié)果和酶切結(jié)果，剔除相同的片段，選擇有代表性的酵母DNA轉(zhuǎn)化E. coli J

4、M109，涂布于LB+Amp培養(yǎng)基平板。并重新提取質(zhì)粒pGADT7-Rec-cDNA，轉(zhuǎn)化酵母AH109，驗證是否與誘餌蛋白具有相互作用。最終獲得5個陽性克隆，測序后，在NCBI上Blast比對分析結(jié)果表明，分別是在油菜生理過程中起著重要作用的基因：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上蛋白轉(zhuǎn)運復(fù)合體a亞基(Scc61a)，陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶復(fù)合體中的一個亞基，1，3-beta葡聚糖苷酶，水解酶以及光系統(tǒng)1L亞單位(PSAL)。 根據(jù)篩選所獲得的其中一個陽

5、性克隆水解酶基因的序列，設(shè)計引物，通過cDNA末端快速擴增的方法擴增基因的未知序列。根據(jù)RACE擴增得到的序列，繼續(xù)設(shè)計引物，通過熱不對稱交錯PCR的方法擴增基因5’未知序列。根據(jù)三次的測序結(jié)果，拼接得到了基因的全長序列，設(shè)計全長引物：up-Primer：5’-TAGTTTAGGGATGCTGTCCAAAAGTGT-3’，down Primer：5’-CAGAAGAATAACCAATCAAAAAACCATC-3’進行PCR擴增，得到了基

6、因的全長cDNA序列。 根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI上進行Blast比對分析，此蛋白質(zhì)序列具有水解酶家族17的保守結(jié)構(gòu)域，與擬南芥的beta-1，3-glucanase具有84％的同源性，可能為水解酶家族的一個成員。利用網(wǎng)站和多種生物學(xué)軟件對推導(dǎo)出的氨基酸序列進行分析。分析結(jié)果表明，此氨基酸序列有以下特征：(1)有信號肽序列，前26個氨基酸序列可能是信號肽；(2)有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。 設(shè)計引物up-Primer 5’AT

7、AGAATTC ATGCTGTCCAAAAGTGTTITFGC TG-3’，down Primer：5’-CAGAAGAATAAC CAATCAAAAAACCATC-3’，用Pfu酶進行PCR擴增后，用EcoR I進行酶切，將此片段連接至經(jīng)過EcoR I和Sma I酶切過的PSK載體。重組質(zhì)粒通過Xba I和EcoR V進行雙酶切，將片段克隆至經(jīng)過Xba Ⅰ和．Ecl136 Ⅱ酶切過的pCAMBIA 2301G載體，構(gòu)建反向植物表達載體