信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PAK4相互作用蛋白質(zhì)的篩選.pdf

1、腫瘤是世界范圍內(nèi)人類疾病，其發(fā)病率持續(xù)上升，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康。因此，對于腫瘤的發(fā)病機(jī)制及診斷治療研究成為我國目前對腫瘤研究的一個重要課題。尋找腫瘤治療靶點是當(dāng)前該領(lǐng)域研究的熱點。其中對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白作用分子機(jī)制的深人了解能使我們認(rèn)識惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的規(guī)律所在，在關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行阻遏，達(dá)到治療腫瘤的目的，是近年來人們探尋腫瘤治療的方向。 P21活化激酶(P21-activatedkinase，PAK)是一類進(jìn)化上

2、保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac下游主要靶蛋白，參與許多重要細(xì)胞活動。到目前為止PAK家族共有6個成員，皆含有氨基末端(N-末端)調(diào)節(jié)區(qū)和羧基末端(C-末端)激酶區(qū)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性，將它們分為兩類，Ⅰ類包括PAK1，PAK2和PAK3，Ⅱ類包括PAK4，PAK5和PAK6。兩類PAK在結(jié)構(gòu)、活化方式、生物學(xué)功能上有很大的區(qū)別，它們具有不同的下游靶蛋白。通過對PAK1下游

3、靶蛋白的研究，我們了解其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。同時，很多學(xué)者相繼報道了一些與PAK4相互作用的靶蛋白，表明其在腫瘤進(jìn)展中存在著與Ⅰ類PAK不同的作用方式。本課題主要是利用酵母雙雜交的方法，從人胎腦cDNA文庫中篩選PAK4相互作用蛋白，進(jìn)一步了解其生物學(xué)特性和功能。 實驗材料與方法一、實驗材料基因克隆相關(guān)分子生物學(xué)試劑酵母雙雜交和酵母蛋白、質(zhì)粒提取相關(guān)試劑 二、實驗方法誘餌融合蛋白pGBKT7-PAK4B/K質(zhì)粒的

4、構(gòu)建在酵母Y187和AH109菌中表達(dá)融合蛋白擴(kuò)增人胎腦cDNA文庫，cDNA文庫大量轉(zhuǎn)染酵母菌AH109利用Mating方法進(jìn)行酵母雙雜交篩選PAK4相互作用蛋白篩選出Ade+/His+/LacZ+陽性轉(zhuǎn)化子、測序分析 結(jié)果SDS-PAGE和Westernblotting檢測顯示，pGBKT7-PAK4B/K融合基因能在酵母Y187和AH109中表達(dá)融合蛋白質(zhì)，利用Mating雜交方法篩選出了多個與PAK4蛋白質(zhì)相互作用的Ad