小鼠CD4相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、研究背景: 哺乳動物精子具有結(jié)合轉(zhuǎn)運外源DNA的能力，精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(sperm-mediated gene transfer，SMGT)是一種簡便、高效的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法。但該方法極大的隨機性與不確定性成了SMGT廣泛運用和推廣的障礙，主要問題是對精子結(jié)合轉(zhuǎn)運外源DNA的機理不明確。目前研究較少，且主要集中在精子膜CD4分子內(nèi)化外源DNA上。CD4是精子質(zhì)膜上的受體和轉(zhuǎn)運候選分子之一，是一種單鏈跨膜蛋白，SMGT方法創(chuàng)始人Lav

2、itrano教授和我們組前期研究都證實CD4分子在精子內(nèi)化轉(zhuǎn)運外源DNA的過程中發(fā)揮重要作用。但封閉CD4分子的精子仍部分具有轉(zhuǎn)運外源DNA的能力，說明精子結(jié)合轉(zhuǎn)運外源DNA不僅有CD4發(fā)揮作用，而是多個分子共同作用的結(jié)果。且蛋白質(zhì)相互作用在生命活動中扮演關(guān)鍵角色，所以篩選鑒定與CD4相互作用、且在精子結(jié)合轉(zhuǎn)運外源DNA中的重要分子，將為精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移機理的研究開辟新的思路，最終為建立簡單、穩(wěn)定、高效的精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法學(xué)奠定基礎(chǔ)。<

3、br>　　材料與方法: 本研究首先構(gòu)建了誘餌載體pGB-mCD4，對其自激活效應(yīng)進行檢測。具體方法是:提取小鼠睪丸組織mRNA，通過RT-PCR獲得mCD4基因片段，將mCD4與pGB質(zhì)粒載體連接構(gòu)建，陽性克隆進行質(zhì)粒提取測序，對陽性克隆載體進行自激活檢測。接著，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)化法對小鼠睪丸cDNA文庫進行篩選，對陽性克隆進行基因測序，序列分別利用GenBank比對，篩選與CD4相互作用的基因，并對其進行初步的生物信息學(xué)分析

4、。最后，檢測mCD4和4種候選分子在哺乳動物293FT細胞中的共表達情況。具體方法是:構(gòu)建真核表達載體 pCDEF-Myc-mCD4, pCDEF-FLAG-BSPRY, pCDEF-FLAG-RANBP9pCDEF-FLAG-CD320， pCDEF-FLAG-Creld2，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化至293FT細胞，轉(zhuǎn)染48h，在熒光顯微鏡和FACS確認轉(zhuǎn)染效率。對細胞裂解物進行了Western blot驗證。
　　結(jié)果: (1)構(gòu)建了

5、誘餌載體pGB-mCD4，mCD4的長度為123bp，經(jīng)電泳、測序檢測為目的片段;誘餌載體轉(zhuǎn)入Y190菌株，經(jīng)β-galactosidase顯色，表明pGB-mCD4不能自激活酵母細胞Y190。(2)睪丸cDNA文庫的轉(zhuǎn)庫效率為9.3×105cfu/μg。轉(zhuǎn)化酵母Y190后培養(yǎng)，有199個克隆在Leu-Trp-His-/SD+3AT培養(yǎng)基平板上生長，隨后進行β-galactosidase顯色反應(yīng)分析，有26個克隆經(jīng)過顯色后變藍，認定為陽

6、性克隆。將26個酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)后，在LB+Ampr平板中生長，再挑單克隆擴增細菌質(zhì)粒。將得到的26個克隆細菌質(zhì)粒與質(zhì)粒pGB-mCD4質(zhì)粒兩兩共轉(zhuǎn)Y190酵母菌，隨后再β-galactosidase顯色反應(yīng)分析，23個樣品變藍，分別將23條基因測序，利用GenBank進行比對，得到的8條陽性基因，分別為:BSPRY(登錄號:NM_138653.1)、Pmpcb(登錄號:NM_028431.2)、RANBP9(登錄號:NM_019

7、930.2)、Morc2b(登錄號:NM_177719.4)、Ggnbp2(登錄號:NM_153144.2)、CD320(登錄號:NM_019421.3)、Adam2(登錄號:NM_009618.2)和Creld2(登錄號:NM_029720.2)。(3)構(gòu)建了真核表達載體pCDEF-Myc-mCD4，pCDEF-FLAG-BSPRY, pCDEF-FLAG-RANBP9, pCDEF-FLAG-CD320和口pCDEF-FLAG-Cr