死亡受體6相互作用蛋白質(zhì)的篩選與鑒定.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文死亡受體6相互作用蛋白質(zhì)的篩選與鑒定姓名：王梁華申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：焦炳華倪健20040401i桀華博士學(xué)位論文fce受體6相互作用蛋白噴的篩選與簽定的相互作用已有驗(yàn)證，由此證實(shí)了細(xì)菌雙雜交可以用于細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用的研究。同時(shí)證實(shí)了OCIF／OPG與TRAIL能直接結(jié)合，但親和力較TRAIL與DR4、TRAIL與DR5要低。二、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)篩選與DR6相互作用的分子以pBT

2、構(gòu)建編碼DR6細(xì)胞外區(qū)域(43234aa)與Fc片段融合表達(dá)的質(zhì)粒，與Stratagene公司購買的細(xì)菌雙雜交用人肝細(xì)胞cDNA文庫(以pTRG構(gòu)建)共轉(zhuǎn)化XLlBlueMRF，錨于250gg／ml羧芐青霉素的LB—CTCK平皿。24h后長出大量菌落(300個／平皿)，隨機(jī)挑選10個克隆進(jìn)行測序結(jié)果顯示篩選到的主要是與Fc片段結(jié)合的蛋白編碼序列。提高羧芐青霉素濃度至500“∥ml陽性克隆略有減少(約100個／平皿)。將DR6細(xì)胞外區(qū)域編

3、碼序列直接插入pBT，按上述方法在500gg／ml羧芐青霉素的LBCTCK平皿上篩選了8輪次，共計(jì)360余塊15cm平皿，每次的轉(zhuǎn)化效率在2107～6107間。結(jié)果共得到1200余個陽性克隆，用XGalPETG平皿進(jìn)一步驗(yàn)證，得到了約300個陽性克隆，全部進(jìn)行了插入片段的序列分析。剔除已知只存在于細(xì)胞內(nèi)(如核內(nèi)、胞漿、線粒體等)的蛋白編碼序列，共12次得到抗胰蛋白酶(alphalantitrypsin)，4次hepsin，2次未知的同一

4、新基因，2次白蛋白，2次補(bǔ)體1T亞單位，2次轉(zhuǎn)鐵蛋白(ferritin)及maspin、克隆刺激因子1受體、AII脂蛋白、C脂蛋白、C反應(yīng)蛋白、視黃酸受體q、血清類粘蛋白】、血清素等編碼序列各1次。調(diào)研文獻(xiàn)分析所報(bào)道這些蛋白的功能和研究現(xiàn)狀，選擇了II型跨膜蛋白絲氨酸蛋白酶家族分子hepsin與絲氨酸蛋白酶抑制劑家族分子maspin進(jìn)行進(jìn)一步研究。三、重組表達(dá)hepsin與maspin，胺化磁珠法分析與DR6的結(jié)合設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，以肝細(xì)

5、胞cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增了其中的hepsin細(xì)胞外區(qū)域和maspin成熟肽的編碼序列，插入pMALTMProteinFusionandPurificationSystem(NewEnglandBiolabs公司)中的pMAL—c2載體，進(jìn)行與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合的原核重組表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用試劑盒所帶的直鏈淀粉親和層封亍柱初步純化，達(dá)到電泳純。DR6細(xì)胞外區(qū)域同樣表達(dá)并純化。將hepsin、maspin及MBP蛋白分別共價(jià)結(jié)