兩個棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白質的篩選與鑒定.pdf

1、在以前的研究中，發(fā)現(xiàn)了兩個棉花14-3-3蛋白質在野生型和棉花纖維發(fā)育突變體中差異表達。其中一個(EST為gi|78344446)在無絮棉突變體-3 DPA胚珠中上調表達，另一個(EST為gi|78324056)在徐州142陸地棉0 DPA胚珠中表達卻在突變體0 DPA胚珠中不表達。表明14-3-3蛋白可能在纖維發(fā)育過程中起到調控作用。14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的調控蛋白，主要通過與其它蛋白發(fā)生相互作用而發(fā)揮調控

2、功能，因此探索14-3-3蛋白的功能應從研究與14-3-3蛋白互作的蛋白入手。
　　 本研究首先克隆了兩個差異表達14-3-3蛋白質的編碼基因全長，然后克隆到pET30原核表達載體上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，IPTG誘導表達后用Ni-NTA樹脂純化出帶有六聯(lián)組氨酸標簽的14-3-3蛋白。從徐州142、徐州142無絮突變體、TM-1和李氏纖維有限伸長突變體的-3、-1、0 DPA胚珠和3、6 DPA纖維中提取總蛋白并等

3、量混合。以該混合蛋白為獵物蛋白質源，以兩個14-3-3蛋白質為誘餌，分別進行pull-down試驗，獲得棉花胚珠與纖維總蛋白中與14-3-3蛋白互作的蛋白，雙向電泳分離后進行質譜分析，鑒定14-3-3相互作用蛋白質，為進一步研究14-3-3蛋白在纖維發(fā)育中的作用打下了基礎。
　　 主要研究結果如下:
　　 1、根據(jù)EST序列（gi|78344446和gi|78324056），利用RACE技術，從陸地棉中克隆2個14-3-

4、3蛋白編碼基因全長，序列比對發(fā)現(xiàn)其中一個是新的棉花14-3-3蛋白家族基因，命名為Gh14-3-3-like protein2（GenBank登錄號:JF320796），另一個序列與Gh14-3-3b（GenBank登錄號:EU189221）僅相差三個氨基酸，可能是同一個蛋白。
　　 2、將兩個14-3-3蛋白編碼基因全長加上六聯(lián)組氨酸標簽并克隆至pET30原核表達載體上，IPTG誘導下，兩個蛋白質均超量表達，SDS-PAGE電

5、泳檢測其分子量大約為30kD，與理論分子量一致。使用Ni-NTA鎳柱純化了這兩個帶6×His標簽的14-3-3蛋白。
　　 3、分別以這兩個蛋白質為誘餌，采用pull-down方法從-3、-1、0 DPA胚珠，3、6 DPA纖維提取的混合蛋白質中分離14-3-3的相互作用蛋白質。對分離的蛋白質進行雙向電泳，MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質譜鑒定蛋白質點。發(fā)現(xiàn)了23個與Gh14-3-3-likeprotein2相互作用的蛋白，其中