棉花GhLFAE相互作用蛋白的篩選與驗(yàn)證.pdf

1、棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)品棉纖維是一種重要的紡織原材料。在棉花的生長過程中，棉纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量直接決定了棉花的生產(chǎn)效益。因此，如何提高棉纖維產(chǎn)質(zhì)是棉花育種的主要目標(biāo)。研究表明，細(xì)胞膜的通透性對棉纖維發(fā)育所需膨壓的維持有著重要的影響。多不飽和脂肪酸(PUFA)作為膜脂的重要構(gòu)成成分，其含量以及成分的變化能直接改變細(xì)胞膜的流動性以及通透性。因此，研究棉纖維細(xì)胞發(fā)育過程中調(diào)控PUFA合成相關(guān)基因，對闡明纖維細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)理具有重要意義

2、，同時，并為棉花育種提供理論依據(jù)，對提高棉花的纖維產(chǎn)量有著重要的理論意義。課題組前期利用酵母雙雜交的方法，以GhSCFP作為誘餌篩選到了一個與擬南芥KCS同源的超長鏈脂肪酸延伸酶GhLFAE（Gossypiumhirsutum Long chain Fatty Acid Elongation enzyme）.在煙草中超量表達(dá)GhLFAE基因促進(jìn)多不飽和脂肪酸(PUFA)的生成，并且可以改變細(xì)胞膜通透性。但是，GhLFAE基因在棉花纖維細(xì)

3、胞發(fā)育過程中的作用以及影響細(xì)胞膜通透性的分子機(jī)制尚不清除。本論文采用酵母雙雜交技術(shù)，以GhLFAE蛋白作為誘餌，篩選與之相互作用的蛋白;然后利用實(shí)時定量PCR分析了與GhLFAE相互作用蛋白編碼以及的表達(dá)特性，最后用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BIFC)的方法驗(yàn)證篩選出的靶蛋白與GhLFAE的相互作用。主要結(jié)果如下:
　　1.誘餌蛋白的自啟動以及毒力檢測
　　成功構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pGBKT-GhLFAE，并對其進(jìn)行了自激活以及毒力測

4、試實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，誘餌蛋白GhLFAE不能單獨(dú)啟動Y2H GOLD菌株中報告基因的表達(dá)，并且對酵母細(xì)胞無毒性，可以進(jìn)行后續(xù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。
　　2.酵母雙雜交篩選，驗(yàn)證與GhLFAE相互作用的蛋白
　　提取棉花8DPA纖維RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA轉(zhuǎn)入酵母Y187中構(gòu)建酵母文庫，與構(gòu)建的含誘餌表達(dá)載體pGBKT-GhLFAE的酵母菌株進(jìn)行雜交，經(jīng)過多次篩選后獲得29個陽性克隆。對這些陽性克隆序列進(jìn)行BLAST比對，分析發(fā)現(xiàn)其

5、分別為:陸地棉藍(lán)銅蛋白GhBCP2（Gossypium hirsutum Blue Copper Protein）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SUT2A、葡聚糖β-1.3-葡糖苷酶前體（PR2）基因以及幾種未知功能蛋白基因。通過共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以及載體互換共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(Swich)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明:在酵母中陸地棉藍(lán)銅蛋白GhBCP2、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SUT2A、葡聚糖β-1.3-葡糖苷酶前體(PR2)均與GhLFAE存在著相互作用。
　　3.表達(dá)分析鑒定相互

6、作用蛋白
　　利用RT-PCR對上述靶蛋白編碼基因在陸地棉的不同組織以及不同發(fā)育時期的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:GhPR2在棉花纖維中的表達(dá)含量較少、其表達(dá)模式與GhLFAE不符、GhSUT在棉花的各組織中均有表達(dá)，GhBCP2在棉花6-8DPA的纖維中優(yōu)勢表達(dá)，其表達(dá)模式與GhLFAE最為接近。所以我們選取GhBCP2進(jìn)行下一步的驗(yàn)證分析。
　　4.雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BIFC)驗(yàn)證GhBCP2與GhLFAE的相互作用