肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（LCMR1）相互作用蛋白的初步篩選.pdf

1、目的：肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(LCMR1)的編碼基因是實(shí)驗(yàn)室采用mRNA差異顯示技術(shù)克隆到的新基因(AY148462)，目前功能不明確，為了研究該基因的功能，采用酵母雙雜交系統(tǒng)從預(yù)轉(zhuǎn)化人肝文庫(kù)篩選LCMR1的相互作用蛋白，為進(jìn)一步研究該基因的功能提供線索。 方法：(1)PCR擴(kuò)增pGEX-5T-LCMR1載體中的LCMR1編碼區(qū)序列，通過(guò)引入EcoRI和PstI內(nèi)切酶位點(diǎn)，將LCMR1編碼區(qū)克隆到酵母雙雜交系統(tǒng)中的pGBKT7載體，

2、得到誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1，轉(zhuǎn)化酵母菌AH109后，檢測(cè)BD-LMCR1融合蛋白的表達(dá)、LCMR1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性及對(duì)宿主菌AH109的毒性；(2)轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1的酵母菌AH109與轉(zhuǎn)化了人肝文庫(kù)質(zhì)粒的酵母菌Y187進(jìn)行交配培養(yǎng)，利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，初步篩選陽(yáng)性克?。?3)重復(fù)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)和去除陽(yáng)性克隆中多余的質(zhì)粒；(4)提取陽(yáng)性克隆中的質(zhì)粒DNA，用PCR和酶切的方法減少重復(fù)克隆，然后轉(zhuǎn)化大

3、腸桿菌DH5α，利用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩選AD文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子，提取AD文庫(kù)質(zhì)粒；(5)將pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒和AD文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，轉(zhuǎn)化混合物鋪板于營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基，再次驗(yàn)證其相互作用；(6)陽(yáng)性克隆中AD文庫(kù)質(zhì)粒測(cè)序及生物信息學(xué)分析。 結(jié)果：(1)PCR和測(cè)序鑒定pGBKT7-LCMR1載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化AH109，BD-LCMR1融合蛋白成功表達(dá)，LCMR1蛋白無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性和宿主毒性；(2)通過(guò)文

4、庫(kù)篩選得到72個(gè)陽(yáng)性克??；(3)經(jīng)報(bào)告基因激活檢測(cè)、多余質(zhì)粒去除剩余57個(gè)克??；(4)經(jīng)酶切歸類獲得30陽(yáng)性克??；(5)共轉(zhuǎn)化再次驗(yàn)證相互作用后仍為陽(yáng)性的克隆有14個(gè)，經(jīng)測(cè)序和信息學(xué)分析，其中非編碼序列7個(gè)，編碼序列7個(gè)，這7個(gè)編碼序列分別是RPL29、RPS15a、HAMP、補(bǔ)體C3、ND4L、ND1和細(xì)胞色素P450。 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)所需的無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性、且對(duì)酵母菌無(wú)毒性的誘餌質(zhì)粒PGBKT7-LCMR1