CLIC2蛋白與Sedlin蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、目的:運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)研究CLIC2蛋白與Sedlin蛋白之間的相互作用:構(gòu)建帶HA標(biāo)簽的CLIC2真核表達(dá)載體PCDNA3.1-HA-CLIC2和帶FLAG標(biāo)簽的Sedlin真核表達(dá)載體PCDNA3.1-FLAG-Sedlin,先分別轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中觀察其各自的分布,再共轉(zhuǎn)染進(jìn)COS7細(xì)胞中觀察兩個(gè)蛋白的共定位情況。將PCDNA3.1-HA-CLIC2和PCDNA3.1-FLAG-Sedlin共轉(zhuǎn)至HEK293T細(xì)

2、胞中,通過免疫共沉淀和Westernblot技術(shù)來檢測CLIC2與Sedlin在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)是否存在相互作用。
　　方法:以含有人CLIC2全長cDNA序列的菌液為模板,設(shè)計(jì)下游帶有HA標(biāo)簽的引物,PCR方法擴(kuò)增目的片段,目的片段經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后與同樣經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切的pCDNA3.1真核表達(dá)載體連接,重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、DNA抽提、酶切鑒定,正確的克隆進(jìn)行測序。測序正確的克隆用于抽提高純度的重組質(zhì)粒PCD

3、NA3.1-HA-CLIC2。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒PCDNA3.1-HA-CLIC2或PCDNA3.1-FLAG-Sedlin轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,培養(yǎng)24h后取出細(xì)胞并固定,然后分別加入一抗和FITC或者TRITC標(biāo)記的二抗,最后封片,用熒光顯微鏡觀察CLIC2,Sedlin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位。將質(zhì)粒PCDNA3.1-HA-CLIC2、PCDNA3.1-FLAG-Sedlin共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,經(jīng)觀察CLIC2蛋白和Sedli

4、n蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),再通過軟件處理疊加,觀察兩個(gè)蛋白的共定位情況,比較單轉(zhuǎn)和雙轉(zhuǎn)CLIC2蛋白和Sedlin蛋白表達(dá)有何異同;將PCDNA3.1-HA-CLIC2、PCDGFP-Sedlin共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,培養(yǎng)48h后裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞裂解液,加入磁珠及HA抗體孵育,通過Westernblot檢測CLIC2蛋白能否將Sedlin蛋白免疫沉淀下來。以此來驗(yàn)證在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)CLIC2蛋白與Sedlin蛋白是否能夠相互結(jié)合。

5、
　　結(jié)果:PCDNA3.1-HA-CLIC2,PCDNA3.1-FLAG-Sedlin真核表達(dá)載體經(jīng)酶切和測序鑒定,各重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。PCDNA3.1-HA-CLIC2質(zhì)粒單轉(zhuǎn)免疫熒光制片、后熒光顯微鏡觀察到外源性的CLIC2在COS7細(xì)胞中大量分布,且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá);PCDNA3.1-FLAG-Sedlin免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果是外源性的Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中的定位也是很廣泛且細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)均有定位。C

6、LIC2蛋白和Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞共定位相當(dāng)明顯,且在細(xì)胞內(nèi)均勻分布定位。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和Westernblot方法檢測證明帶HA標(biāo)簽的CLIC2蛋白能夠?qū)FP標(biāo)簽的Sedlin蛋白免疫沉淀下來,表明CLIC2跟Sedlin能在HEK293T細(xì)胞中相互結(jié)合。
　　結(jié)論:免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CLIC2蛋白在COS7細(xì)胞中表達(dá)并不只是在生物膜系統(tǒng),且胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有大量分布,這與它是以游離型和膜結(jié)合型兩種形式存在的特性是