補體C3及其缺失突變體與CLIC1蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、目的：本實驗為研究C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白與CLIC1蛋白的相互作用，分別構(gòu)建帶FLAG標簽的C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)的真核表達載體，將C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染至COS7細胞，觀察各組分蛋白在細胞中的定位；構(gòu)建缺失突變體酵母表達載體，進行酵母雙雜交實驗；通過將C3及其缺失突變體C3(1-840)、C

2、3(824-1663)質(zhì)粒與CLIC1蛋白共同瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，通過免疫共沉淀技術(shù)，在哺乳動物細胞內(nèi)，檢測C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白與CLIC1蛋白的相互作用。
　　方法：根據(jù)PCR方法分別擴增野生型C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)序列，酶切回收目的片段，插入到pCDNA3.1載體上，構(gòu)建pCDNA3.1-C3-FLAG、pCDNA3.1-C3(1-

3、840)-FLAG、pCDNA3.1-C3(824-1663)-FLAG質(zhì)粒；用同樣的方法構(gòu)建pGADT7-C3(1-840)、pGADT7-C3(824-1663)、pGBKT7-C3(1-840)和pGBKT7-C3(824-1663)酵母表達載體，對于酶切鑒定正確的質(zhì)粒，跟Marker對比后正確的送往測序公司測序。分別將C3的缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)和CLIC1的酵母表達載體，共同轉(zhuǎn)化至酵母菌AH10

4、9中，在SD/-Leu/-Trp/-His/3AT/X-α-gal固體培養(yǎng)基上進行篩選，利用酵母雙雜交技術(shù)，檢測C3的缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)和CLIC1蛋白在酵母細胞中大致的蛋白質(zhì)相互作用。把已構(gòu)建成功的pCDNA3.1-C3-FLAG、pCDNA3.1-C3(1-840)-FLAG、pCDNA3.1-C3(824-1663)-FLAG質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到COS7細胞中，細胞制片后在熒光顯微鏡下觀察；分別將帶F

5、LAG標簽的C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)與帶GFP標簽的CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到HEK293T細胞，通過免疫共沉技術(shù)，檢測C3及其缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在HEK293T細胞中的相互作用。
　　結(jié)果：根據(jù)測序公司的測序結(jié)果比對基因序列確定構(gòu)建是否成功。酵母實驗中，共表達C3及其缺失突變體C3(1-840)與CLIC1兩種融合蛋白后細胞沒有變藍，而共表達C3(824-1663)與CLIC1兩種融合

6、蛋白后，在酵母盤子中有細胞變藍，說明有相互作用；在免疫熒光顯微鏡下觀察，在COS7細胞中，C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白主要分布在細胞質(zhì)中，在細胞核中幾乎沒有，CLIC1蛋白的分布主要在細胞核內(nèi)，尤其是在核膜上，細胞質(zhì)中較少分布；而C3(824-1663)的缺失突變體蛋白的定位除在細胞質(zhì)中分布外，在核膜處有斑點集中分布。共定位實驗觀察到缺失突變體C3(824-1663)與CLIC1蛋白在細胞質(zhì)中有共定