Phb1與CLIC1相互作用的初步研究.pdf

1、目的：酵母雙雜交技術(shù)證實(shí)phb1與CLIC1在酵母中的相互作用；構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的phb1真核表達(dá)載體和帶GFP標(biāo)簽的CLIC1真核表達(dá)載體；將其共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，觀察其在哺乳細(xì)胞株內(nèi)的共定位的具體情況；轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀，檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)phb1蛋白與CLIC1蛋白能否相互結(jié)合。
　　 方法：以含人phb1全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒pLenti6-phb1為模板，用PCR方法擴(kuò)增phb1全長(zhǎng)序列，雙

2、酶切后回收目的片段，連接到載體pGADT7上，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGADT7-phb1；雙酶切pGADT7-phb1 回收目的片段，連接到載體pGBKT7上，構(gòu)建載體pGBKT7-phb1；以pACT2-CLIC1為模板，用PCR方法擴(kuò)增CLIC1全長(zhǎng)序列，BamHⅠ單酶切回收目的片段，連接到pGBKT7上，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGBKT7-CLIC1和pGADT7-CLIC1。把測(cè)序正確的酵母表達(dá)載體分組轉(zhuǎn)化至酵母菌AH109，在SD/-L

3、eu/-Trp/-His/＋3-AT/X-α-gal盤上篩選藍(lán)色的克隆。呈藍(lán)色的克隆是α-gal活性為陽(yáng)性的克隆，再通過(guò)濾膜印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定b-半乳糖苷酶活性進(jìn)一步驗(yàn)證它們的相互作用情況。用PCR方法擴(kuò)增phb1全長(zhǎng)序列構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-FLAG-phb1，后轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察其在細(xì)胞的定位；將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光顯微鏡觀

4、察phb1蛋白和CLIC1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況；將質(zhì)粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，提取細(xì)胞裂解液，進(jìn)行免疫共沉淀，后通過(guò)Western blot檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)phb1蛋白與CLIC1蛋白能否結(jié)合。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，各組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。營(yíng)養(yǎng)篩選及α，b-半乳糖苷酶活性的測(cè)定均表明phb1和CLIC1能相互作用；pCDNA3-FLAG-phb1和pC

5、DGFP-CLIC1轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中，免疫熒光顯微鏡觀察phb1和CLIC1共定位于細(xì)胞核周圍區(qū)域；免疫共沉淀和Western blot檢測(cè)證明phb1蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T細(xì)胞中相互結(jié)合。
　　 結(jié)論：酵母雙雜交系統(tǒng)3初步證實(shí)phb1和CLIC1之間存在相互作用；免疫熒光顯微鏡觀察pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1在COS7細(xì)胞中存在共定位，主要聚集于胞質(zhì)中；免疫共沉淀和Western