CXCR4與eEF1A1相互作用與腎癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、目的：腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤，約有三分之一的腎癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)即已為晚期。轉(zhuǎn)移性腎癌目前尚無(wú)有效治療方法，五年生存率不到20％，嚴(yán)重影響我國(guó)人民的生命健康。CXCR4是一種趨化因子，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理病理功能。國(guó)內(nèi)外大量研究證據(jù)表明CXCR4與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，現(xiàn)在認(rèn)為其活化后可以激活下游多種信號(hào)通路從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)指在探尋CXCR4在腎癌細(xì)胞中相互作用的蛋白和DNA，豐富CXCR4促進(jìn)腎癌轉(zhuǎn)移的通路。
　　方法：

2、
　　1.課題組已構(gòu)建包裝高表達(dá)CXCR4-EGFP的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染病毒得到過(guò)表達(dá)CXCR4的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光顯微鏡和定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　　2.利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)ACHN細(xì)胞內(nèi)與CXCR4相互作用的蛋白和DNA，通過(guò)質(zhì)譜分析和測(cè)序分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)與ACHN相互作用的蛋白和DNA。
　　3.針對(duì)質(zhì)譜分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。質(zhì)譜分析得到與CXCR4結(jié)合的蛋白有eEF1A1(

3、Eukrryotic Translation Elongation Factor1 Alpha1，eEF1A1)。設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的siRNA使其低表達(dá)，包裝干擾慢病毒，轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)的ACHN細(xì)胞系。
　　4.通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和實(shí)驗(yàn)研究其與腎癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)染EGFP慢病毒的ACHN細(xì)胞，eEF1A1干擾的ACHN-EGFP細(xì)胞，高表達(dá)CXCR4的ACHN-CXCR4細(xì)胞及干擾eEF1

4、A1的ACHN-CXCR4細(xì)胞進(jìn)行CCK8增殖、流式細(xì)胞凋亡、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，探討eEF1A1對(duì)腎癌細(xì)胞功能的影響，并通過(guò)比較在CXCR4高表達(dá)時(shí)敲低eEF1A1表達(dá)來(lái)初步探討CXCR4與eEF1A1相互作用對(duì)腎癌細(xì)胞功能的影響。
　　5.選取98例腎癌標(biāo)本構(gòu)建組織芯片，進(jìn)行免疫組化染色，統(tǒng)計(jì)各標(biāo)本eEF1A1表達(dá)量的高低，結(jié)合患者的預(yù)后，初步探討eEF1A1與腎癌預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建

5、過(guò)表達(dá)CXCR4-EGFP融合蛋白的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見(jiàn)ACHN細(xì)胞＞90％發(fā)出綠色熒光，實(shí)時(shí)定量PCR顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-EGFP過(guò)表達(dá)病毒后ACHN內(nèi)CXCR4表達(dá)量提高7499倍，蛋白質(zhì)免疫印跡顯示融合蛋白大量表達(dá)。
　　2.免疫共沉淀獲取和CXCR4相互作用的蛋白質(zhì)，跑膠后送質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析提示約在50KDa位置存在條帶可能是eEF1A1。進(jìn)一步通過(guò)western驗(yàn)證此結(jié)論，在5

6、0KDa附近位置加入eEF1A1一抗，有明確條帶顯示，證實(shí)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN內(nèi)CXCR4與eEF1A1存在相互作用。
　　3.通過(guò)查詢(xún)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)eEF1A1的干擾RNA，干擾序列為GCACCAUGAAGCUUUGAGUGAAGCTTGCUUCACUCAAAGCUUCAUGGUGCTT。此序列構(gòu)建shRNA干擾慢病毒并轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞和ACHN-CXCR4細(xì)胞，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和western驗(yàn)證干擾效率約為70％，即干擾

7、組eEF1A1的表達(dá)量下調(diào)70％，至此構(gòu)建eEF1A1干擾慢病毒并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ACHN細(xì)胞系成功。
　　4.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾eEF1A1后腎癌細(xì)胞的凋亡稍增加，增殖減慢，遷移無(wú)明顯變化。高表達(dá)CXCR4的ACHN-CXCR4在干擾掉eEF1A1后凋亡明顯增加，增殖減慢幅度更大，而遷移能力無(wú)明顯變化。提示eEF1A1增強(qiáng)了腎癌細(xì)胞的增殖能力，而其部分機(jī)制可能是通過(guò)與CXCR4相互作用實(shí)現(xiàn)的。而eEF1A1對(duì)腎癌細(xì)胞的遷移能力無(wú)